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May 26, 2023

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Virology Journal volumen 20, Número de artículo: 142 (2023) Citar este artículo 524 Accesos 3 Detalles de Altmetric Metrics El SARS-CoV-2 ha provocado una pandemia mundial desde diciembre de 2019 y la búsqueda de

Revista de Virología volumen 20, Número de artículo: 142 (2023) Citar este artículo

524 Accesos

3 altmétrico

Detalles de métricas

El SARS-CoV-2 ha provocado una pandemia mundial desde diciembre de 2019 y la búsqueda de dianas farmacéuticas contra el COVID-19 sigue siendo un desafío importante. Aquí, estudiamos la proteína E de la envoltura del SARS-CoV y el SARS-CoV-2, una viroporina de 75 a 76 aminoácidos altamente conservada que es crucial para el ensamblaje y liberación del virus. Los canales de la proteína E se expresaron de forma recombinante en células HEK293, un péptido señal que dirige la membrana aseguró la transferencia a la membrana plasmática.

La actividad del canal de viroporina de ambas proteínas E se investigó mediante electrofisiología de parche-clamp en combinación con un ensayo de viabilidad celular. Verificamos la inhibición por los inhibidores clásicos de viroporina amantadina, rimantadina y 5-(N,N-hexametilen)-amilorida, y probamos cuatro derivados de ivermectina.

Los inhibidores clásicos mostraron una potente actividad en los registros de parche-clamp y en los ensayos de viabilidad. Por el contrario, la ivermectina y la milbemicina inhibieron el canal E en los registros con parche, pero solo mostraron una actividad moderada sobre la proteína E en el ensayo de viabilidad celular, que también es sensible a la actividad citotóxica general de los compuestos probados. La nemadectina y la aglicona de ivermectina estaban inactivas. Todos los derivados de ivermectina fueron citotóxicos en concentraciones > 5 µM, es decir, por debajo del nivel requerido para la inhibición de la proteína E.

Este estudio demuestra la inhibición directa de la proteína E del SARS-CoV-2 mediante inhibidores clásicos de viroporina. La ivermectina y la milbemicina inhiben el canal de la proteína E, pero su citotoxicidad va en contra de su aplicación clínica.

Los coronavirus han sido responsables de importantes brotes de enfermedades respiratorias SARS, MERS y de la epidemia de COVID-19 de 2019, causada por SARS-CoV-2 [1]. La infección grave por SARS-CoV-2 provoca un deterioro grave de la función pulmonar, a menudo asociado con inflamación sistémica y una liberación masiva de citocinas inflamatorias, conocida como tormenta de citocinas [2,3,4], que también se conoce en otras enfermedades relacionadas con virus. [5,6,7]. Una campaña mundial de vacunación era esencial para reducir la propagación de la COVID-19, pero han surgido nuevas cepas de SARS-CoV-2 y existe un riesgo persistente de aparición de nuevas cepas que sean parcialmente [8], o incluso completamente resistentes. a las vacunas actuales. Además de la prevención de la infección mediante la vacunación, el tratamiento eficaz de los pacientes infectados es una necesidad esencial en la lucha contra el SARS-CoV-2.

El SARS-CoV-2 es un virus de ARN monocatenario de sentido positivo envuelto que comprende 14 marcos de lectura abiertos en su genoma. Estos codifican proteínas estructurales, que forman la cápside del virus, incluidas la proteína de espiga (S), la proteína de membrana (M), la proteína de la envoltura (E) y la proteína de la nucleocápside (N), así como proteínas no estructurales, incluidas las de el aparato viral de replicasa y proteasa, y proteínas accesorias [3].

La proteína de envoltura E y la proteína ORF3a del SARS-CoV-2 pertenecen a la clase de viroporinas, un grupo de proteínas de membrana integrales, en su mayoría pequeñas e hidrofóbicas, que se ensamblan en canales de membrana, generalmente ubicados en las membranas intracelulares del RE y el aparato de Golgi [9 ,10,11]. Al ser esenciales para la replicación y liberación del virus, las viroporinas son de hecho objetivos viables para los medicamentos antivirales [9, 10, 12, 13]. La primera viroporina bien caracterizada fue el canal M2 del virus de la influenza A [14,15,16]. Otras viroporinas son el canal p7 de la hepatitis C [17, 18] y la proteína viral U del virus de la inmunodeficiencia humana [19]. Las viroporinas están involucradas en el ciclo de infección viral de dos maneras: (i) causando desequilibrios iónicos y alterando los gradientes de pH a través de su acción como canales iónicos intracelulares, y (ii) alterando las vías celulares a través de interacciones proteína-proteína [2, 9, 12, 20].

Las proteínas E se encuentran en todos los coronavirus y, a pesar de la variación en el tamaño y la secuencia de las proteínas (75 a 109 aminoácidos) [21], su estructura está altamente conservada, incluido un segmento N-terminal corto, una sección alfa helicoidal larga que probablemente incluya una transmembrana. dominio y un extremo carboxi no estructurado [9]. La secuencia de la proteína E está altamente conservada entre el SARS-CoV (1-E) y el SARS-CoV-2 (2-E), que se diferencian por una deleción y tres residuos intercambiados, todos ubicados cerca del extremo C-terminal de la Proteína de 76 aminoácidos.

Los estudios sobre la proteína E del SARS-CoV expresada de forma recombinante identifican la proteína en la membrana plasmática celular [22], pero esto no pudo confirmarse en estudios posteriores [23]. La actividad del canal de viroporina se confirmó utilizando bicapas lipídicas planas y micelas donde la proteína E forma estructuras oligoméricas que construyen el poro del canal iónico [22, 24, 25].

El genoma del SARS-CoV codifica tres supuestas viroporinas, la proteína E, las proteínas ORF3a y ORF8a [12]. La actividad de las proteínas E y 3a es necesaria para la máxima replicación y virulencia del SARS-CoV, con una viabilidad viral reducida si una de las dos viroporinas estaba inactiva y una pérdida completa de la replicación viral si ambas estaban ausentes. Por el contrario, la proteína ORF 8a no era necesaria para la actividad del virus [12]. El mismo estudio demostró en un modelo de ratón de infección por SARS-CoV que tanto la actividad del canal iónico de la proteína E como las interacciones intracelulares mediadas por su motivo de unión a PDZ son necesarias para la virulencia [12]. La eliminación del gen E en diferentes coronavirus conduce a una reducción de la maduración y liberación del virus, a la producción de virus de baja virulencia y a una reducción del estrés celular y de la apoptosis inducida por virus [26, 27]. Tanto la proteína E como la ORF3a del SARS-CoV y el SARS-CoV-2 muestran una alta conservación de secuencia y una función similar, mientras que no se informó que las proteínas ORF8 fueran viroporinas [9]. Por lo tanto, tanto E como ORF3a son dianas farmacéuticas viables [12, 26], y un inhibidor o una combinación de inhibidores que pueda atacar ambas viroporinas sería una herramienta terapéutica prometedora para el tratamiento de COVID-19.

Los inhibidores clásicos de viroporina incluyen amantadina y rimantadina [18, 28, 29], 5-(N,N-hexametilen)amilorida (HMA) [22, 30] y varios derivados de iminoazúcar [29, 31]. Recientemente, hemos demostrado que algunos miembros de la familia de los flavonoides son inhibidores de los canales de la proteína E recombinante del SARS-CoV [32].

La ivermectina, un antihelmíntico y modulador de canales iónicos bien caracterizado [33, 34], se ha explorado en numerosos estudios por su uso potencial en la lucha contra el SARS-CoV-2 [35], pero los resultados son ambiguos, observándose cierta actividad solo en algunos estados de infección [36,37,38,39] y la toxicidad asociada a la ivermectina limitan su uso clínico, similar a su acción contra el virus de Newcastle [36]. Aquí, probamos la ivermectina y tres de sus derivados, a saber, nemadectina, milbemicina y aglicón de ivermectina, para determinar su actividad contra la proteína E recombinante del SARS-CoV-2 expresada en células HEK293. En estudios de viabilidad celular, se observó el efecto de la ivermectina sobre la actividad de la proteína E, pero no se pudo separar de la citotoxicidad de la ivermectina en sí. En los estudios electrofisiológicos con parche-clamp, la ivermectina fue un potente inhibidor de la proteína E, la milbemicina también mostró actividad, mientras que la inhibición por la aglicona de ivermectina fue menos pronunciada y la nemadectina estaba inactiva. Así, identificamos la proteína E del SARS-CoV-2 como un objetivo farmacológico directo para los inhibidores de viroporina. Si bien se confirmó que algunos derivados de ivermectina son potentes inhibidores del canal de la proteína E, la aplicabilidad clínica de estos compuestos está limitada por su citotoxicidad.

Generación de la construcción de proteína E del SARS-CoV-2. Se utilizó como plantilla el ADNc que codifica la proteína E del SARS-CoV (1-E) [32] para introducir las mutaciones necesarias (T55S, V56F, E69R, G70del) para generar un plásmido. codifica la proteína E del SARS-CoV-2 (2-E) mediante mutagénesis dirigida a través de un protocolo de PCR de extensión superpuesta [18]. Se insertó ADNc 2-E en el vector pRK5 usando sitios de restricción EcoRI y PstI. Para mediciones electrofisiológicas, se fusionó un péptido señal director de membrana 'MWTPRVPPPRPALSFFLLLLLGVTYGLFPEEPPPLSVAE' de semaforina-6B murina, seguido de una etiqueta myc para análisis de transferencia Western al extremo N-terminal de la proteína E. Todas las construcciones fueron verificadas por secuenciacion. La proteína E se expresó en células HEK293 para análisis de transferencia Western, ensayos MTT y mediciones electrofisiológicas.

Cultivo celular y transfección Se cultivaron células HEK293 (ATCC, LGC Standards GmbH, Wesel, Alemania) en placas de cultivo de tejidos de 10 cm en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma-Aldrich, El Cairo, Egipto) suplementado con FBS al 10% (Invitrogen, Karlsruhe). , Alemania) y 1000 UI de penicilina/estreptomicina (Sigma-Aldrich, El Cairo, Egipto) al 5% de CO2 y 37 °C en una atmósfera saturada de agua.

Análisis de transferencia Western Las células se sembraron en placas de 6 cm y se transfectaron usando 4 µg de ADNc y 12 µg de PEI por placa. Tres días después de la transfección, se recolectaron células HEK293, se preparó una fracción de membrana cruda mediante dos rondas de homogeneización seguida de centrifugación a 14000 g durante 20 minutos, y se sometieron a SDS-PAGE y transferencia Western. Se utilizaron un anticuerpo primario policlonal de conejo anti-c-myc (Proteintech, Martinsried, Alemania) y un anticuerpo secundario anti-conejo de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (Proteintech, Martinsried, Alemania) y la transferencia se visualizó utilizando azul nitro de tetrazolio al 0,03 % y 0,02 % de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato en tampón de sustrato (Tris-HCl 100 mM, pH 9,5; NaCl 100 mM; MgCl2 5 mM). Dado que la proteína E era inestable y se degradaba rápidamente, todas las operaciones se realizaron inmediatamente después de la cosecha, utilizando solución salina tamponada con fosfato que contenía inhibidores de proteasa (Roche C@mplete, Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemania) y se calentó a 95 °C durante 2 min inmediatamente antes de cargar el gel SDS. Esta degradación minimizada; sin embargo, los oligómeros no se separan completamente con este tratamiento. La concentración de proteína se determinó mediante un ensayo Qbit (Thermofisher, Karlsruhe, Alemania) y se aplicaron 20 μg de proteína total por carril.

Ensayo de expresión de la superficie celular Se transfectaron células HEK293 con construcciones de ADNc que codifican la proteína E del SARS-CoV-2 marcada con myc (2-E) y la proteína E del SARS-CoV-2 con un péptido señal director de membrana (2E-SP). Se utilizaron como control células HEK293 no transfectadas y células transfectadas con GFP. Las células vivas se incubaron con un anticuerpo anti-myc primario de conejo durante 1 h, luego con un anticuerpo anti-conejo de cabra acoplado a fosfatasa alcalina secundario durante 30 min. Luego se recogieron las células, se homogeneizaron y la suspensión celular se colocó en pocillos de un aparato de transferencia Dot. La transferencia se desarrolló utilizando NBT/BCIP y se analizó. La intensidad de los píxeles se cuantificó utilizando el software ImageJ sin corrección adicional de los datos sin procesar. Las intensidades de píxeles para cada pico se normalizaron con respecto a la intensidad total de píxeles de todos los picos. Se tomaron promedios de lecturas duplicadas de tres experimentos de expresión independientes (n = 6). Para la visualización (Fig. 1E), se restó la intensidad de fondo (células no transfectadas) de las intensidades puntuales registradas.

A Derivados de ivermectina utilizados en este estudio. B Alineación de secuencia de proteínas E de SARS-CoV (1-E), SARS-CoV-2 (2-E) y variantes recientes de 2-E. Los recuadros indican las cuatro posiciones de diferencia entre 1-E (naranja) y 2-E, el color amarillo indica los intercambios de aminoácidos que se encuentran en 2-E de las nuevas variantes del SARS-CoV-2. C Modelo estructural de vista lateral y superior de la proteína CoV E (código PDB: 5 × 29) determinado por espectroscopia de RMN en micelas de liso-miristoil fosfatidil-glicerol [59] Las cinco subunidades están codificadas por colores; los residuos N- y C-terminales están marcados para una sola subunidad. D Análisis de transferencia Western de la proteína 2-E y viroporinas de control expresadas en células HEK293. Todas las viroporinas tenían una etiqueta myc N-terminal. Antes de la carga, las muestras se calentaron brevemente a 95 °C para minimizar la degradación, pero los multímeros no se separaron por completo. La tinción se realizó utilizando un anticuerpo anti-myc primario y un AB secundario conjugado con AP. Carril 1: Escalera (ROTI®Mark TRICOLOR: 10, 15, 20, 25, 35, 45, 60, 75); carril 2: GFP; carril 3: proteína E del SARS-CoV-2 más péptido señal; carril 4: proteína E del SARS-CoV-2 sin péptido señal; carril 5: proteína E del SARS-CoV sin péptido señal; carril 6: virus de la hepatitis C p7-1a; carril 7: SARS-CoV-2 ORF3a. Pesos moleculares esperados (kD): SARS-CoV-2 E: 12,6; SARS-CoV-2 E+SP: 16,8, virus de la hepatitis C p7-1a: 11,3; SARS-CoV-2 ORF 3a: 35,6 kD Péptido señal (SP): 4,2; Dímero E del SARS-CoV-2: 25,2; trímero: 37,8 kD; Dímero p7-1a del virus de la hepatitis C: 22,6; trímero: 33,9. Tenga en cuenta que la señal inmune solo se observa para los anticuerpos etiquetados con myc. Las viroporinas pequeñas no migran de la misma manera que las proteínas marcadoras globulares. Los oligómeros sugeridos (●, ●●, ●●●) y las bandas de degradación (x) se indican entre los carriles 3 y 4 para las proteínas E, y a la derecha del carril 6 y 7 para p7-1a y ORF3a, respectivamente. Análisis de expresión de superficie E: Se transfectaron células HEK293 con ADNc que codifica la proteína E (E) y la proteína E con péptido señal director de membrana (E-SP); se utilizaron células no transfectadas y transfectadas simuladamente como control. Panel izquierdo: mancha de puntos. Panel derecho: se muestra la cuantificación de las intensidades de transferencia, promedio ± desviación estándar de tres experimentos independientes con dos puntos por tratamiento (n = 6). La ruptura del eje y está entre 0,001 y 0,02. La señal de fondo (células no transfectadas = sin ADN) se restó de las intensidades puntuales; Se indican los valores de p, **: p < 0,01, ns: no significativo, p > 0,05 (ANOVA unidireccional)

Ensayo de viabilidad celular Los ensayos de viabilidad celular se realizaron como se describió anteriormente [29]. Brevemente, se sembró una suspensión de células HEK293 en placas de 96 pocillos y se transfectó un día después del cultivo en placas utilizando 0,3 µg de ADN y 0,6 µg de PEI por pocillo. Se añadió inhibidor madre (5 µl de volumen final) en diferentes concentraciones y se realizó el ensayo MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltazolk-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) después de tres días como se describe [29]. Las células viables producen un derivado de formazán de MTT de color púrpura que se disolvió mediante la eliminación cuidadosa de la solución de MTT y la adición de 100 µl de DMSO por pocillo. Las absorbancias a 595 nm se registraron utilizando un lector de placas Victor-3 (Perkin-Elmer, Berlín, Alemania). La viabilidad de las células transfectadas con el constructo de expresión 2-E se normalizó para controlar las células transfectadas con el vector pRK5 vacío. Se restó la absorbancia de fondo (KCl 200 mM). A continuación, dividimos las lecturas de la prueba por las lecturas de control (células transfectadas simuladas), normalizando así los datos de control al valor 1. Comparamos la proteína E del SARS-CoV y el SARS-CoV-2 en condiciones experimentales idénticas. Los controles adicionales incluyeron: (1) células transfectadas con GFP para verificar la transfección eficiente; (2) comparación de células no transfectadas con células transfectadas con pRK5 para identificar el efecto de la transfección sobre la viabilidad celular; (3) adición de KCl 200 mM para inducir la muerte celular completa. (4) Para probar si los inhibidores tenían algún efecto sobre la viabilidad celular, también se agregaron a células transfectadas simuladas (vector vacío). La viabilidad celular de las células tratadas con inhibidor transfectadas con proteína E se normalizó con respecto a la viabilidad de las células de control tratadas con la misma concentración de inhibidor.

Registros electrofisiológicos y análisis de datos Las células se sembraron en cubreobjetos de vidrio tratados con acetona en placas de 24 pocillos, se transfectaron un día después del paso utilizando 1 µg de ADNc de proteína E, 1 µg de ADNc de proteína de fluorescencia verde (GFP) y 3 µl de polietilenimina (PEI) (1 mg/ml) (Sigma-Aldrich, El Cairo, Egipto) por pocillo. Los registros con parche se realizaron 2 a 3 días después de la transfección. Para el registro, las células se mantuvieron en una solución de baño (tampón externo) que contenía NaCl 135 mM, KCl 5,5 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1,0 mM y Hepes 10 mM (pH 7,4 con NaOH). Las pipetas de registro se extrajeron de vidrio de borosilicato (World Precision Instruments, Berlín, Alemania) utilizando un extractor horizontal Sutter P-97 (Sutter, Novato, CA). El tampón intracelular fue (en mM) 140 CsCl, 1,0 CaCl2, 2,0 MgCl2, 5,0 EGTA y 10 Hepes (pH ajustado a 7,2 con CsOH). Las células de control se transfectaron con el vector pRK5 cotransfectado con GFP y se compararon con células transfectadas con proteína E y GFP. La actividad del canal de la proteína E se evaluó utilizando relaciones corriente-voltaje desde una rampa de voltaje que oscilaba entre −60 mV y +50 mV en pasos de 10 mV. Para medir la inhibición, se añadieron compuestos de prueba al baño extracelular. Se registraron y promediaron un mínimo de 6 células por condición.

Para comparar la función y la inhibición de las proteínas E del SARS-CoV (1-E) y el SARS-CoV-2 (2-E), generamos construcciones 2-E introduciendo el intercambio/eliminación de las cuatro posiciones que son diferentes entre 2 -E y 1-E. Además de los inhibidores clásicos de viroporina amantadina, rimantadina y HMA, se probaron la ivermectina y tres de sus derivados, a saber, ivermectina aglicón, nemadectina y milbemicina (Fig. 1A). Una alineación de secuencia entre el SARS-CoV y todas las variantes de CoV-2 muestra una alta conservación entre las proteínas E e identifica cuatro de los 76 residuos que se intercambian entre 1-E y 2-E (Fig. 1B). La proteína exhibe una estructura pentamérica con un poro central (Fig. 1C) y el extremo C (que contiene los cuatro intercambios) de cada subunidad apuntando en dirección opuesta al poro del canal. La expresión recombinante de 1-E se ha demostrado anteriormente [32]. La proteína 2-E se expresó en células HEK293 y el análisis de transferencia Western confirmó la expresión de la proteína diana (Fig. 1D). Se añadió un péptido señal que dirige la membrana para promover el transporte de los canales de la proteína E a la superficie celular. Una transferencia Western de 2-E con o sin péptido señal fusionado (Fig. 1D) mostró señales inmunes correspondientes a la proteína 2-E como monómero, dímeros y posibles trímeros. Los controles fueron la viroporina p7-1a del virus de la hepatitis C, que también muestra oligómeros, y el ORF3a del SARS-CoV-2 [40]. Debido a la inestabilidad de la proteína E, la preparación de la membrana se llevó a cabo en presencia de inhibidores de proteasa y, antes de la carga, las muestras se calentaron sólo brevemente para evitar la degradación (ver métodos). Este tratamiento conservó la señal de la proteína E; sin embargo, los oligómeros no se separaron completamente. Incluso entonces, se pudieron observar bandas de degradación prominentes (Fig. 1D). El conjugado 2-E-SP mostró sólo una banda en la región monomérica esperada, pero ninguna banda para la proteína E conjugada con el péptido señal, lo que indica una escisión eficaz del péptido señal. En general, el experimento indica una expresión recombinante exitosa de la proteína E en células HEK 293. La expresión de la superficie celular se verificó mediante un ensayo de transferencia puntual (Fig. 1E), donde las células se transfectaron primero con construcciones 2-E y las células vivas se trataron con anticuerpos primarios (anti-myc) y secundarios antes de la lisis celular y la mancha directa en una transferencia. membrana. De esta manera, el anticuerpo sólo podía acceder a las proteínas de la superficie celular externa. Las transferencias de puntos mostraron una señal inmune en la superficie celular, verificando la expresión de la membrana plasmática, e indicaron que la expresión en la superficie celular era más alta para la proteína 2-E que contenía el péptido señal (Fig. 1E).

Actividad de la proteína E Comparamos la actividad de la proteína E del SARS-CoV con su nueva variante del SARS-CoV-2 en un ensayo de viabilidad celular y mediciones electrofisiológicas con parche. El control para ambos experimentos fueron células transfectadas con un vector vacío que, por lo demás, se trataron de la misma manera que el experimento de prueba. En el ensayo de viabilidad celular, la presencia de proteína E activa debilitó y eventualmente dañó las células, por lo que la viabilidad celular reducida indica actividad de la proteína E. De hecho, las viabilidades observadas de las células HEK293 que expresan la proteína E o una construcción de control fueron significativamente diferentes y la proteína E provocó una reducción de la viabilidad de las células transfectadas (Fig. 2). Las actividades de ambas proteínas E fueron casi idénticas, ambas redujeron la fracción de células viables a ~ la mitad del nivel del control (Niveles de viabilidad Control: 1,00 ± 0,16, 1-E = 0,51 ± 0,17, 2-E = 0,52 ± 0,17, Figura 2A).

Una comparación de SARS-CoV 1-E y 2-E analizados mediante ensayo MTT. Las absorbancias a 595 nm se normalizaron para el control simulado (vector pRK). B Mediciones electrofisiológicas en células HEK293 transfectadas. Las células transfectadas 1-E (cuadrado cruzado) y 2-E (cuadrado sólido) se compararon con células de control transfectadas simuladas (vector pRK vacío, círculos abiertos). Las barras de error son la desviación estándar (SD); El número de células fue 16 (pRK) y 14 (1-E, 2-E). C Resumen de datos electrofisiológicos: se muestran corrientes promedio a − 60 mV ± desviación estándar, se indica significancia (ANOVA unidireccional), *: p < 0,05, **: p < 0,01

Luego comparamos la actividad del canal de ambas proteínas E utilizando electrofisiología de abrazadera de parche de células completas donde la actividad del canal transmembrana, es decir, el flujo de iones a través de la membrana, se mide directamente. Analizamos las relaciones corriente-voltaje en un rango de - 60 a + 50 mV. Las células de control mostraron corrientes de fondo (fuga) de −0,98 ± 0,05 nA a −60 mV. La expresión de la proteína E debería inducir corrientes mayores debido a la actividad de su canal. Como se esperaba, las corrientes después de la expresión de viroporina aumentaron significativamente en comparación con el control (Fig. 2B). Al comparar ambas proteínas E en condiciones idénticas, las corrientes mediadas por 2-E fueron ligeramente menores, sin embargo, esta diferencia no fue significativa (1-E = 1,45 ± 0,07 nA, 2-E = 1,35 ± 0,11 nA, p = 0,28).

Inhibición por rimantadina, amantadina y HMA Investigamos la actividad de los inhibidores de viroporina clásicos sobre la proteína 2-E y la comparamos con la de la proteína 1-E, que se había publicado anteriormente [32]. En el ensayo de viabilidad celular, la expresión de la proteína 2-E en células HEK293 y la inhibición con rimantadina, amantadina y HMA mostraron valores de CI50 de 8,9 ± 2,2 µM, 89 ± 27 µM y 1,5 ± 0,3 µM, respectivamente (Fig. 3A, B). Estas actividades fueron comparables a los datos de inhibición de la proteína 1-E publicada (IC50 de Rim = 10,9 ± 3,3 µM, Ama = 77 ± 13 µM, HMA = 2,6 ± 0,4 µM) [32]. Si bien la amantadina y la rimantadina no fueron citotóxicas en el rango de concentración probado, el HMA mostró efectos citotóxicos en concentraciones > 10 µM, como se había informado anteriormente [29, 41]. Las mediciones electrofisiológicas en células HEK293 que expresan 2-E (Fig. 3C) revelaron el mismo patrón de actividad para todos los inhibidores clásicos, siendo HMA el más activo, luego rimantadina y amantadina el menos activo (Rim IC50 = 3,6 ± 0,6 nM, Ama IC50 = 24,1 ± 6,5 nM, HMA IC50 = 1,9 ± 0,3 nM, Fig. 3 D, E). Cabe señalar que la electrofisiología de patch-clamp se realizó directamente en las células donde la proteína E estaba presente en la membrana plasmática externa debido a la secuencia de señal que dirige la membrana. Esta configuración experimental permite una interacción directa del canal de la proteína E y el inhibidor. Los valores de IC50 de los inhibidores establecidos a partir de experimentos de patch-clamp son, por tanto, mucho más pequeños que los obtenidos a partir de ensayos celulares en los que el inhibidor primero tiene que entrar en las células antes de unirse a su objetivo. Al comparar los datos de inhibición del patch-clamp de 2-E con los de 1-E, observamos el mismo patrón de potencia inhibidora (HMA > rimantadina > amantadina) para ambos canales, mientras que hay una pequeña diferencia en el grado de inhibición, con actividad reducida para 2-E en comparación con 1-E (factor de ~ 2).

Inhibición de la proteína 2-E por los inhibidores clásicos de viroporina rimantadina (Rim), amantadina (Ama) y hexametilenamilorida (HMA). Un ensayo de viabilidad celular. La absorbancia relativa se normalizó para el control (transfección simulada). B Resumen de datos de IC50. C Relación corriente-voltaje de 2-E expresado de forma recombinante en células HEK293. El voltaje transmembrana se incrementó en intervalos de 10 mV en el rango de -60 a +50 mV y se registraron las corrientes asociadas. Los controles fueron células HEK293 transfectadas de forma simulada (vector pRK vacío). La expresión de 2-E dio como resultado un aumento de las corrientes que se redujeron en presencia del inhibidor. Los paneles de izquierda a derecha representan a Rim, Ama y HMA. Las concentraciones se indican en la figura. D Las relaciones corriente-voltaje para Rim, Ama y HMA se convirtieron en una curva IC50 a −60 mV y se normalizaron entre Irel = 0 (transfectado simuladamente) e Irel = 1 (proteína E del SARS-CoV-2 sin inhibidor); Irel = corriente relativa. E Resumen de datos de IC50 de Rim, Ama y HMA de electrofisiología de parche-clamp

Inhibición por ivermectina y derivados. Como control, estudiamos el efecto de ivermectina, aglicona de ivermectina, milbemicina y nemadectina en células HEK293 transfectadas de forma simulada en un ensayo de viabilidad celular. Todos los derivados de ivermectina mostraron una citotoxicidad notable. El inicio de la toxicidad celular varió entre los experimentos y fue más pronunciado para la nemadectina, donde ya se observó daño celular a 2 µM (Fig. 4A). Los rangos de concentración del inhibidor (0,2 a 2 µM para ivermectina y milbemicina; 0,5 a 5 µM para ivermectina aglicona y nemadectina) se eligieron en base a datos electrofisiológicos realizados simultáneamente que muestran actividades más altas para ivermectina y milbemicina que para ivermectina aglicona y nemadectina. Para todos los derivados de ivermectina, la inhibición de la proteína 2-E en el ensayo de viabilidad celular (Fig. 4B) fue menos distinta que la observada en ensayos anteriores para inhibidores clásicos o flavonoides [32]. Sólo la ivermectina mostró efectos inhibidores a la concentración más alta probada (2 µM). Una razón para la aparente reducción de la potencia inhibidora de los derivados de la ivermectina podría ser la toxicidad de los propios compuestos, que superpone el efecto inhibidor. Además, la ivermectina y sus derivados están asociados a la membrana y es posible que no alcancen fácilmente el destino intracelular en la membrana del RE-Golgi. En las mediciones electrofisiológicas, los aspectos de toxicidad son irrelevantes ya que todas las concentraciones de fármaco son mucho más pequeñas y por lo tanto no tóxicas, mientras que la segunda limitación potencial en el ensayo de viabilidad celular (la ivermectina no alcanza su destino intracelular) no se aplica aquí, ya que las viroporinas están expuestas en la membrana plasmática externa. Las corrientes mediadas por la proteína E se midieron en rampas de voltaje entre −60 y + 50 mV registradas en ausencia y presencia de concentraciones crecientes de inhibidor (Fig. 5A). La inhibición completa dio como resultado corrientes que se redujeron a la magnitud de las células HEK293 transfectadas de forma simulada. Representamos gráficamente las corrientes relativas frente a la concentración de inhibidor y determinamos los valores de IC50 utilizando una forma modificada de la ecuación de Hill \({I}_{inh}={I}_{ctr}\bullet \frac{{IC}_{50}^{ n}}{{IC}_{50}^{n}+[{inh]}^{n}}\), donde Iinh es la corriente en presencia de inhibidor, Ictr es la corriente en ausencia de inhibidor, [inh ] es la concentración de inhibidor y n es el coeficiente de Hill para la inhibición (Fig. 5B). Nuestras mediciones mostraron inhibición de las corrientes mediadas por la proteína E por todos los derivados de ivermectina excepto la nemadectina. Los valores de IC50 fueron: IC50 (ivermectina) = 0,88 ± 0,1 nM, IC50 (aglicón de ivermectina) = 5,0 ± 1,3 nM y IC50 (milbemicina) = 2,21 ± 0,65 µM. No observamos inhibición de la proteína 2-E por nemadectina en ninguna de las concentraciones analizadas. En resumen, podemos observar que la ivermectina y algunos de sus derivados inhiben la proteína E en la aplicación directa (electrofisiología), mientras que la inhibición en el ensayo celular indirecto (ensayo de viabilidad celular) se redujo en gran medida para la ivermectina y no fue mensurable para sus derivados.

Prueba de viabilidad celular para la inhibición de la proteína E del SARS-CoV y CoV-2 por la ivermectina (Ivm) y derivados. Una prueba de citotoxicidad en células de control (transfectadas simuladamente). Abs595 indica la viabilidad celular, se indican los significados estadísticos relativos a los valores de control (sin inhibidor) (ANOVA en camino). Los derivados de ivermectina fueron citotóxicos en concentraciones ≥ 5 µM, excepto milbemicina, donde el inicio de la toxicidad comenzó a ~10 µM. Ensayos de viabilidad de células B después de la expresión recobinante de 1-E (columnas grises) y 2-E (columnas negras) en células HEK293. Los inhibidores se aplicaron después de la transfección. La ivermectina (Ivm) y la milbemicina (Mil) se probaron en un rango de 0,2 a 2 µM, mientras que la ivermectina agilcon (IAP y la nemadectina (Nem) se probaron en 0,5 a 5 µM. El control fueron células transfectadas simuladamente con pRK. Viabilidad celular de viroporina- Las células transfectadas se normalizaron con respecto a la viabilidad de las células de control (transfectadas simuladamente) expuestas a la misma concentración de inhibidor. Se indica la significación estadística (ANOVA unidireccional) en relación con los valores de viabilidad de 1-E o 2-E sin inhibidor, ns : no significativo, *: p < 0,05, **: p < 0,01

Pruebas de electrofisiología patch-clamp para la inhibición de la proteína E del SARS-CoV-2 por la ivermectina y sus derivados. Una relación corriente-voltaje de controles simulados expresados ​​recombinantemente y proteína 2-E. Los voltajes aplicados estuvieron entre −60 y +50 mV. Las corrientes de control se tomaron de células HEK293 transfectadas de forma simulada (vector pRK). Los paneles de izquierda a derecha muestran ivermectina (Iv), ivermectina aglicona (IA), milbemicina (Mil) y nemadectina (Nem). Las concentraciones se indican en los gráficos. B Curvas de concentración-respuesta: las corrientes a -60 mV se corrigieron para detectar la corriente de fuga (células transfectadas simuladamente); las corrientes corregidas observadas para 2-E en presencia de inhibidor se dividieron por las corrientes corregidas en ausencia de inhibidor. Los símbolos se indican en el gráfico. C Resumen de los valores de CI50 de los derivados de ivermectina frente a 2-E recombinante

El antihelmíntico avermectina se descubrió en 1975 como un aislado de bacterias naturales en el suelo encontrado cerca de Tokio, Japón [33]. A pesar de una intensa búsqueda, los microorganismos japoneses siguen siendo la única fuente de avermectina jamás encontrada. La ivermectina, un derivado de avermectina seguro y más eficaz, se introdujo inicialmente como producto comercial para Salud Animal en 1981. Es eficaz contra una amplia gama de parásitos, incluidos nematodos gastrointestinales, gusanos pulmonares, ácaros, piojos y moscas córneas [33]. En la salud humana, la ivermectina se hizo más famosa por su actividad contra una variedad de infecciones internas causadas por nematodos, incluida la oncocercosis (ceguera de los ríos), la ascariasis, la filariasis linfática, la gnatostomiasis, la tricuriasis y otras [33, 42]. El fármaco antihelmíntico ivermectina actúa inhibiendo la actividad neuronal y la contractilidad muscular en artrópodos y nematodos. Se cree que el objetivo clásico de su acción antiparasitaria es un receptor del canal de cloruro activado por glutamato (GluClR) sensible a la ivermectina que existe en varios invertebrados [34]. Los GluClR pertenecen a la familia de receptores pentaméricos Cys-loop de canales iónicos activados por ligando y se encuentran exclusivamente en invertebrados. La ivermectina en concentraciones más altas también activa los receptores Cys-loop de los vertebrados, incluidos los receptores nicotínicos excitadores e inhibidores GABA tipo A y los receptores de glicina [34]. Se sabe que la ivermectina se une al receptor inhibidor de glicina en un sitio específico, actuando como un agonista completo [43, 44] mientras actúa como efector alostérico positivo del receptor GABAA y del receptor neuronal nicotínico de acetilcolina alfa7 [45, 46]. Si bien los valores de CE50 de la ivermectina en el receptor de glicina están en el rango µM, su potencia como agonista de GluClR en invertebrados es 1000 veces mayor con valores de CE50 en el rango bajo de nM [47]. Ésta es la razón por la que la ivermectina es muy eficaz contra los nematodos, pero no supone ningún riesgo para la salud humana en bajas concentraciones. De hecho, se esperaba que la proteína E u orf3a de los SARS-CoV pudiera ser un objetivo potencial para la ivermectina.

Aquí, investigamos la actividad de la ivermectina en la proteína E del SARS-CoV-2 utilizando una combinación de un ensayo de viabilidad celular y registros electrofisiológicos de parche-pinza de células completas. Los ensayos de transferencia Western y Dot blot confirmaron la expresión de la proteína E en la membrana externa de las células HEK293 y la escisión eficiente del péptido señal que dirige la membrana. Se ha informado de la expresión de trazas de proteína E expresada de forma recombinante en la membrana plasmática de las células huésped [48], que podría mejorarse mediante la adición del péptido señal. El ensayo de viabilidad celular se introdujo para los canales p7 [29] y la proteína E del SARS-CoV [32] y es un complemento de las mediciones directas de la actividad de los canales de la electrofisiología de patch-clamp.

Primero, comparamos la actividad de las proteínas E del SARS-CoV (1-E) y del SARS-CoV-2 (2-E) utilizando ambos ensayos, encontrando el mismo nivel de toxicidad celular (sin diferencia significativa) del 1-E recombinante. Proteína E y 2-E expresadas en células HEK293. Consistentemente, las grabaciones de patch-clamp confirmaron niveles similares de actividad para las proteínas 1-E y 2-E después de la expresión recombinante en células HEK293. Por lo tanto, el intercambio de cuatro residuos de aminoácidos entre 1-E y 2-E (Fig. 1B) no pareció afectar la actividad del canal iónico. A continuación, comparamos la sensibilidad de ambas proteínas E del SARS-CoV frente a los bloqueadores de canales clásicos, que ya se habían publicado para 1-E [32]. En el ensayo de viabilidad celular, los valores de CI50 de amantadina, rimantadina y HMA fueron similares frente a 1-E y 2-E. En los registros electrofisiológicos observamos un factor de 2 entre ambas variantes, mientras que el orden de sensibilidad a los tres inhibidores se mantuvo igual. El inhibidor más potente fue la HMA, luego la rimantadina y el menos activo fue la amantadina. Las diferencias observadas entre las variantes de la proteína E 1-E y 2-E probablemente se debieron a diferencias específicas de la expresión, particularmente porque la secuencia de la potencia inhibidora y la actividad general del canal no cambiaron entre ambas variantes de la proteína E.

Finalmente, investigamos el efecto de la ivermectina y tres derivados sobre la proteína 2-E. Recientemente, se demostró que la ivermectina exhibe una reducción de 5000 veces en el ARN viral del SARS-CoV-2 in vitro en células Vero-h/SLAM [49]. Se propusieron varios mecanismos mediante los cuales la ivermectina podría inhibir la COVID-19 inducida por el SARS-CoV-2. Los enfoques de acoplamiento molecular sugieren que la inhibición por parte de la ivermectina de la ARN polimerasa dependiente de ARN, que es necesaria para la replicación viral, inhibe el COVID-19 [50], mientras que otro estudio encontró que la ivermectina se dirige al heterodímero importina-α/β1, lo que resulta en la abolición del transporte nuclear de SARS-CoV-2 [51]. Hasta donde sabemos, hasta ahora no se han publicado datos sobre la proteína 2-E como posible socio de unión de la ivermectina. De hecho, en los últimos dos años se han publicado numerosos estudios in vivo que muestran resultados considerablemente variables, una discrepancia que puede racionalizarse cuando se considera el efecto combinado de las actividades antiviral y citotóxica de la ivermectina. Los estudios incluyeron el uso de ivermectina en profilaxis, contra casos leves a moderados de COVID-19 y con pacientes que necesitan cuidados intensivos. Si bien algunos estudios consideran que la ivermectina es el primer agente eficaz tanto para la prevención de la COVID-19 como para el tratamiento de todas las fases, incluido el tratamiento ambulatorio de la fase sintomática temprana [37, 52,53,54]; otros estudios encuentran que la ivermectina no tiene ningún efecto [55, 56]. Varios estudios encontraron efectos protectores de la ivermectina en el tratamiento de pacientes; sin embargo, las diferencias no fueron estadísticamente significativas o se informó una certeza baja de la evidencia [39, 57]. A pesar de la situación clínica poco clara y de las advertencias contra su uso, en varios países se había promovido la ivermectina para el tratamiento de la COVID-19.

Nuestro estudio se centró en la investigación in vitro para descubrir si la ivermectina actúa sobre la proteína del canal E del SARS-CoV-2. El canal E se expresa intracelularmente en el retículo endoplásmico-compartimento intermedio de Golgi (ERGIC) [23]. Por lo tanto, en el ensayo de viabilidad celular, cualquier fármaco debe ingresar a las células HEK293 transfectadas, solo entonces su acción inhibidora puede reducir el daño celular debido a la actividad de la proteína E. La ivermectina es hidrófoba y está asociada a la membrana; en el caso del receptor de glicina, su bolsillo de unión se encuentra dentro de la región transmembrana extracelular [58]. Es posible que la ivermectina no ingrese a las células en una concentración lo suficientemente alta como para inhibir la proteína E de manera efectiva. En nuestros experimentos, las concentraciones disponibles del fármaco eran limitadas, ya que la ivermectina y sus derivados eran citotóxicos en concentraciones de alrededor de 2 a 10 µM, es decir, en el rango de concentración requerido para la inhibición de la proteína E. La toxicidad de la ivermectina en dosis terapéuticas se observó anteriormente en células de fibroblastos primarios de pollo [36]. En electrofisiología de patch-clamp, utilizamos un plásmido que incluía una secuencia señal para dirigir el canal de la proteína E a la membrana externa. En este caso, la viroporina se expuso a inhibidores en el tampón extracelular y pudimos estudiar directamente la actividad de los inhibidores aplicados. Esta fue la razón de los valores de IC50 más bajos en comparación con el ensayo de viabilidad celular indirecto para los inhibidores clásicos. Para la ivermectina y algunos de sus derivados encontramos un valor de IC50 similar al de la rimantadina (IC50 = 3,6 ± 0,6 nM). Utilizando las relaciones corriente-voltaje medidas en presencia y ausencia de inhibidor, encontramos que la ivermectina tiene la mayor actividad (IC50 = 0,88 ± 0,1 nM), la milbemicina fue ligeramente menos activa (IC50 = 2,21 ± 0,65 nM), seguida por la aglicona de ivermectina (IC50 = 5,0 ± 1,3 nM); la nemadectina estuvo inactiva en nuestras mediciones. Nuestros datos de electrofisiología in vitro muestran que la ivermectina actúa como un inhibidor del canal E con una potencia similar a la de la rimantadina. Esta actividad no pudo demostrarse en ensayos de viabilidad celular, probablemente debido a la administración ineficaz del fármaco en los compartimentos intracelulares de las células HEK293 y a la toxicidad celular de la ivermectina y sus derivados. Nuestros datos concuerdan con los hallazgos de la literatura que muestran que la ivermectina tiene algunos efectos beneficiosos en el tratamiento de pacientes infectados con SARS-CoV-2. Las discrepancias observadas podrían explicarse por la ineficiencia en la entrega de medicamentos. La mayoría de los estudios describieron efectos modestos para los pacientes infectados con COVID-19 que estaban en el límite de la significación estadística. Cuando se investigó la profilaxis, el efecto positivo del tratamiento con ivermectina fue más pronunciado. Estos hallazgos coinciden en que la ivermectina tiene un efecto inhibidor sobre el virus (contra la proteína E u otras proteínas), pero con una baja eficacia. Si la carga viral ya es alta en un momento en que los pacientes observan síntomas de COVID-19, el tratamiento con ivermectina no tiene ningún efecto. En caso de aplicación profiláctica, la ivermectina podría inhibir la propagación del virus, aunque sólo en concentraciones en las que ya existe riesgo de efectos secundarios citotóxicos.

Este estudio muestra que la proteína E del SARS-CoV y del SARS-CoV-2 es el objetivo directo de los medicamentos antivirales. La ivermectina y algunos de sus derivados pueden ser inhibidores potentes del canal de la proteína E, pero su citotoxicidad puede hacerlos inadecuados para aplicaciones terapéuticas. Por lo tanto, es necesario evaluar cuidadosamente la actividad contra la proteína diana viral, así como los efectos secundarios perjudiciales. Las viroporinas, como las proteínas E y 3a de los SARS-CoV, siguen siendo objetivos prometedores y relevantes en la búsqueda de nuevos fármacos antivirales.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Esta investigación no recibió ninguna subvención específica de agencias de financiación del sector público, comercial o sin fines de lucro.

Departamento de Bioquímica, Universidad Alemana en El Cairo, Entrada principal de Al Tagamoa Al Khames, Nuevo Cairo, 11835, Egipto

Ulrike Breitinger, Christine Adel Sedky y Hans-Georg Breitinger

División de Bioinformática, Instituto de Bioquímica, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, Erlangen, Alemania

Heinrich Sticht

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UB: concepción, diseño del trabajo, adquisición y análisis de datos, interpretación de datos, redacción, redacción y revisión del manuscrito. CS: adquisición y análisis de datos, interpretación de datos, revisión del manuscrito. HS: concepción, análisis de datos, interpretación de datos, revisión del manuscrito. HGB: concepción, diseño del trabajo, adquisición y análisis de datos, interpretación de datos, redacción, redacción y revisión del manuscrito. Todos los autores han aprobado la versión enviada (y cualquier versión sustancialmente modificada que implique la contribución del autor al estudio); Todos los autores han aceptado ser personalmente responsables de sus propias contribuciones y garantizar que las cuestiones relacionadas con la exactitud o integridad de cualquier parte del trabajo, incluso aquellas en las que el autor no participó personalmente, se investiguen, resuelvan y resuelvan adecuadamente. resolución documentada en la literatura.

Correspondencia a Ulrike Breitinger.

No aplica.

No aplica.

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Reimpresiones y permisos

Breitinger, U., Sedky, CA, Sticht, H. et al. Los estudios de parche-clamp y los ensayos de viabilidad celular sugieren un sitio distinto para los inhibidores de viroporina en la proteína E del SARS-CoV-2. Virol J 20, 142 (2023). https://doi.org/10.1186/s12985-023-02095-y

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Recibido: 30 de julio de 2022

Aceptado: 08 de junio de 2023

Publicado: 08 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12985-023-02095-y

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