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Dec 16, 2023

El Akt

Scientific Reports volumen 5, Número de artículo: 15881 (2015) Cita este artículo 3194 Accesos 34 Citas Detalles de métricas El corazón tiene dos modalidades principales de hipertrofia en respuesta a la hemodinámica.

Scientific Reports volumen 5, número de artículo: 15881 (2015) Citar este artículo

3194 Accesos

34 citas

Detalles de métricas

El corazón tiene dos modalidades principales de hipertrofia en respuesta a cargas hemodinámicas: hipertrofia concéntrica y excéntrica causada por presión y sobrecarga de volumen (VO), respectivamente. Sin embargo, el mecanismo molecular de la hipertrofia excéntrica sigue siendo poco conocido. Aquí demostramos que el eje Akt-mamífero objetivo de la rapamicina (mTOR) es un regulador fundamental de la hipertrofia excéntrica durante el VO. Mientras que mTOR en el corazón se activó de manera dependiente de la presión diastólica final del ventrículo izquierdo (DPVI), la inhibición de mTOR suprimió la hipertrofia excéntrica e indujo atrofia cardíaca incluso bajo VO. En particular, Akt fue ubiquitinado y fosforilado en respuesta al VO y el bloqueo del reclutamiento de Akt en la membrana abolió por completo la activación de mTOR. Varios factores de crecimiento estuvieron regulados positivamente durante el VO, lo que sugiere que podrían estar involucrados en la activación de Akt-mTOR. Además, la tasa de progresión de la hipertrofia excéntrica fue proporcional a la actividad de mTOR, lo que permitió una estimación precisa de la hipertrofia excéntrica mediante la integración temporal de la actividad de mTOR. Estos resultados sugirieron que el eje Akt-mTOR desempeña un papel fundamental en la hipertrofia excéntrica y la actividad mTOR determina cuantitativamente la tasa de progresión de la hipertrofia excéntrica. Como la hipertrofia excéntrica es un sistema inherente del corazón para regular el gasto cardíaco y la DPVI, nuestros hallazgos proporcionan una nueva visión mecanicista del mecanismo adaptativo del corazón.

El corazón es un órgano vital que mantiene la homeostasis en el cuerpo a través de la circulación sanguínea. Para mantener la circulación sanguínea en los tejidos periféricos, el corazón es capaz de remodelarse en respuesta a diversas tensiones, incluida la carga hemodinámica, las neurohormonas, el estrés oxidativo y las citocinas1,2,3. Entre ellas, las cargas mecánicas son aportes importantes para el corazón porque el corazón está incesantemente sujeto a tensiones hemodinámicas. Dado que la carga mecánica induce hipertrofia, las fuerzas de estiramiento mecánico en sístole y diástole en miocitos in vivo pueden calcularse como tensiones de pared en sístole y diástole de acuerdo con la ley de Laplace. En 1975, Grossman et al. demostraron que la sobrecarga de presión (PO) aumenta el estrés de la pared sistólica, lo que resulta en una hipertrofia concéntrica, que a su vez normaliza el estrés de la pared sistólica y que la sobrecarga de volumen (VO) aumenta el estrés de la pared diastólica, lo que resulta en una hipertrofia excéntrica1. Basándose en esta observación clínica, propusieron que la respuesta hipertrófica era provocada por un aumento de la tensión en la pared1. Actualmente, está ampliamente aceptado que el aumento de las tensiones sistólicas y diastólicas de la pared conducen a una hipertrofia concéntrica y excéntrica, respectivamente4. Muchas líneas de evidencia indican que la hipertrofia concéntrica y excéntrica difieren no sólo en términos de fenotipo sino también en las vías de señalización intracelular involucradas5,6. Diversos estudios investigaron el mecanismo molecular de la hipertrofia, especialmente en la hipertrofia concéntrica causada por PO7,8; sin embargo, el mecanismo molecular de la hipertrofia excéntrica aún no se ha dilucidado por completo.

La insuficiencia mitral y aórtica son fisiopatologías típicas que causan VO, especialmente en la fase aguda9. En esas fisiopatologías, el gasto directo neto insuficiente induce inevitablemente congestión pulmonar resultante del aumento de la presión diastólica final del ventrículo izquierdo (DPVI) y la tensión diastólica de la pared del ventrículo izquierdo (VI). La hipertrofia excéntrica aumenta el gasto cardíaco y permite mantener el gasto neto hacia adelante en presencia de regurgitación, disminuyendo así la DPVI y resolviendo la congestión pulmonar9. Por lo tanto, parece que el estrés diastólico de la pared, definido por la DPVI y la geometría del VI, desencadena la hipertrofia excéntrica como un sistema de retroalimentación fisiológicamente bien diseñado para regular la DPVI.

Además, en la insuficiencia cardíaca (IC), el corazón está expuesto a un estrés diastólico excesivo en la pared independientemente de la etiología, ya que la IC es un síndrome caracterizado por un gasto cardíaco bajo y congestión pulmonar (debido a una DPVI alta). Por lo tanto, la comprensión del mecanismo molecular aún por dilucidar de la hipertrofia excéntrica durante el VO es importante para comprender completamente la fisiopatología de la insuficiencia cardíaca.

Grant y cols. y Grossman et al. propusieron que, en términos fisiológicos, la hipertrofia excéntrica es análoga al crecimiento cardíaco normal, ya que ambos procesos aumentan el gasto cardíaco, lo que indica que los cambios estructurales de la hipertrofia excéntrica y el crecimiento cardíaco comparten un mecanismo común1,10. La vía de señalización fosfoinositida-3 quinasa/proteína quinasa B/diana de rapamicina en mamíferos (PI3K/Akt/mTOR) desempeña un papel importante en el crecimiento de células y órganos11. mTOR se identificó a principios de la década de 199012,13 y es la proteína central de dos complejos funcionalmente distintos, que se denominan complejo mTOR 1 (mTORC1) y complejo mTOR 2 (mTORC2)11,14. mTORC1 se activa mediante diversas señales que incluyen insulina, factores de crecimiento, calcio y aminoácidos, a través de receptores como el receptor de tirosina quinasas y los receptores acoplados a proteína G15,16. mTORC1 funciona como una serina/treonina quinasa y fosforila p70S6K en Thr389 y 4E-BP en Thr37/46 y Ulk-1 en Ser757, regulando así la síntesis de proteínas y la macroautofagia, respectivamente17,18. mTORC1 regula el crecimiento celular a través de la síntesis de proteínas y se ha informado que las vías mTOR e Hippo colaboran para determinar el tamaño de los órganos19,20. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la hipertrofia excéntrica está regulada por la activación de mTORC1 en respuesta al estrés diastólico de la pared.

En el campo de la cardiología, Sadoshima e Izumo describieron por primera vez el papel de mTOR en la hipertrofia de los miocitos inducida por angiotensina II21. Además, se demostró que mTOR participa en la hipertrofia inducida por PO y en la remodelación del VI después de un infarto de miocardio en ratones22,23. Si bien estos estudios indicaron que mTOR desempeña un papel clave en la fisiología y patología del corazón24, aún se desconoce el mecanismo preciso de regulación de mTOR en el corazón.

En este estudio, demostramos que el eje Akt-mTOR regula la hipertrofia excéntrica durante el VO en respuesta al estrés diastólico de la pared y que la actividad mTOR determina la tasa de progresión de la hipertrofia excéntrica, al mostrar que el peso del corazón (HW) durante el VO puede ser medido con precisión. estimado por integración temporal de la actividad mTOR.

Primero establecimos un modelo de hipertrofia excéntrica acompañado de un aumento en la masa del corazón y del VI y dilatación del VI mediante la creación de una fístula arteriovenosa (FAV) en la aorta abdominal, sin ninguna alternancia detectable en el espesor medio de la pared (Fig. 1a-e). En este modelo, la hipertrofia cardíaca aumentó de manera constante hasta el día 28, con un aumento leve pero significativo del diámetro del ventrículo izquierdo en sístole (DVI) y un deterioro de la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (FEVI) (Fig. 1f, g). La DPVI y el estrés diastólico de la pared alcanzaron un máximo el día 7 y disminuyeron posteriormente, volviendo a los valores iniciales el día 28 (Fig. 1h, i). El aumento inicial de la DPVI hasta el día 7 puede deberse a una retención compensatoria de volumen para preservar la presión sistémica, especialmente en los riñones, mientras que la normalización de la DPVI y el estrés de la pared diastólica después del día 7 fueron consistentes con el curso temporal del VO crónico causado. por insuficiencia mitral o aórtica en humanos9. Vale la pena señalar que el VO no cambió la frecuencia cardíaca ni la presión máxima (Figuras complementarias S1a, b), lo que indica que el estrés hemodinámico en este modelo de VO se debió exclusivamente al estrés diastólico de la pared. Estos resultados sugirieron que la hipertrofia excéntrica resultante del estrés diastólico de la pared durante el VO es un sistema de retroalimentación fisiológica para regular la PDFVI que amortigua una precarga excesiva a través de la dilatación del VI.

Hipertrofia cardíaca, función y hemodinámica durante el VO después de la creación de la FAV.

(a) Ecocardiograma del VO después de la creación de la FAV. (b – i) peso del corazón (HW) (b), peso del ventrículo izquierdo (LV) del ventrículo izquierdo (LV) (c), diámetro del ventrículo izquierdo en diástole (LVDd) (d), espesor medio de la pared (promedio del tabique interventricular y la pared posterior del ventrículo izquierdo) (e), diámetro del ventrículo izquierdo en sístole (DVI) (f), fracción de eyección del ventrículo izquierdo (FEVI) (g), presión diastólica final del ventrículo izquierdo (DPVI) (h), estrés de la pared diastólica ( i) durante el curso de 4 semanas de VO. Los datos se muestran como la media ± SEM (n = 4). *P < 0,05, **P < 0,01 frente al día 0 (prueba de Dunnett).

La hipertrofia excéntrica implica alteraciones estructurales del corazón que aumentan el gasto cardíaco y que son fisiológicamente similares a las que ocurren durante el crecimiento cardíaco, en las que la vía de señalización PI3K/Akt/mTOR juega un papel importante. Por lo tanto, se investigó el papel de mTORC1 en la mediación de la hipertrofia excéntrica mediante la evaluación del estado de fosforilación de S6 y 4E-BP. El aumento de la fosforilación de las dos proteínas indicó que la actividad de mTOR aumentó de manera dependiente del estrés de la pared diastólica durante el VO (Fig. 2a). La relación entre el estrés diastólico de la pared y la relación S6/S6 fosforilada siguió una curva sigmoidea (R2 = 0,90) (Fig. 2b). Para excluir la posibilidad de que el estímulo prolongado alterara la transducción de señales en la activación de mTOR inducida por estiramiento mecánico durante la fase tardía, se evaluó la actividad de mTOR en el miocardio 24 h después de la creación de la FAV. El corazón fue sometido a diferentes cargas diastólicas a las 24 h alterando el tamaño de la derivación mediante agujas penetrantes de varios tamaños. Como se esperaba, la elevación de la DPVI dependió del tamaño de la derivación (Fig. 2c) y la fosforilación de S6 y 4E-BP, es decir, la activación de mTOR, se correlacionó con la DPVI (Fig. 2d). La relación S6/S6 fosforilada estaba bien correlacionada cuadráticamente con la DPVI (R2 = 0,92) (Fig. 2e). Estos resultados sugirieron que el estrés diastólico de la pared gobierna la actividad mTOR.

Relación entre LVEDP y actividad mTOR.

( a ) Transferencia Western de lisados ​​​​celulares obtenidos de tejido cardíaco durante 4 semanas de VO, sondados para S6 y 4E-BP total y fosforilado. (b) Relación entre el estrés diastólico de la pared y la actividad mTOR durante 4 semanas de VO. (c) Presión diastólica final del ventrículo izquierdo (DPVI) a las 24 h después de la inducción del VO mediante el uso de agujas de varios tamaños para penetrar la vena/arteria (n = 3). ( d ) Transferencia Western de lisados ​​​​celulares obtenidos de tejido cardíaco 24 h después de la inducción de VO utilizando varios tamaños de agujas para penetrar la arteria, sondados para detectar S6 y 4E-BP total y fosforilado. (e) Relación entre la DPVI y la tasa de fosforilación de S6 a las 24 h después de la inducción de VO. Se utilizó GAPDH como control de carga. Los datos se muestran como la media ± SEM. **P < 0,01 frente a simulación (prueba de Dunnett).

Para aclarar el papel de mTOR en la hipertrofia excéntrica, investigamos los efectos del temsirolimus, un inhibidor alostérico de mTOR y un derivado de rapamicina, sobre la hipertrofia excéntrica. La inhibición de mTOR no solo suprimió la hipertrofia excéntrica sino que también indujo atrofia cardíaca, que se caracterizó por una disminución en el diámetro del VI en diástole (LVDd) y HW, junto con la desfosforilación de S6 y 4E-BP (Fig. 3a-c). Curiosamente, la tasa de supervivencia bajo VO fue significativamente menor en el grupo tratado con temsirolimus que en el grupo tratado con vehículo, mientras que los DVI y la FEVI se conservaron en todos los grupos (Fig. 3d, Fig. Suplementaria S2). Estos resultados sugirieron que mTOR es un regulador fundamental de la hipertrofia excéntrica durante el VO y que la hipertrofia excéntrica es esencial para la supervivencia bajo el VO agudo.

Efecto de la inhibición de mTOR sobre la hipertrofia excéntrica durante el VO.

(a) Ecocardiograma de ratones operados con FAV o de forma simulada tratados con temsirolimus (Tem) o vehículo (Veh) el día 3 después de la creación de la FAV. (b) LVDd (panel izquierdo) y HW/longitud tibial (panel derecho) el día 3 de VO (n = 3–4). (c) Transferencia Western de lisados ​​celulares obtenidos de tejido cardíaco de ratones operados con FAV o simulados tratados con Tem o Veh el día 3 de VO, analizados para detectar S6 y 4E-BP total y fosforilado. Se utilizó GAPDH como control de carga. ( d ) Análisis de supervivencia de ratones operados de FAV o simulados tratados con Tem o Veh durante 7 días de VO. Los datos se muestran como la media ± SEM. *P < 0,05, **P < 0,01 frente a simulación, #P < 0,05, ##P < 0,01 frente a VO + Veh (ANOVA unidireccional). El análisis de supervivencia se realizó mediante el método de Kaplan-Meier y las diferencias en supervivencia entre grupos se evaluaron con la prueba de rangos logarítmicos.

Además, también se examinó el efecto atrófico de la inhibición de mTOR sobre la hipertrofia excéntrica establecida. Los ratones operados por FAV se asignaron aleatoriamente a grupos tratados con temsirolimus y vehículo 4 semanas después de la creación de la FAV y se les administró temsirolimus o vehículo durante 1 semana (Figura complementaria S3a). La inhibición de mTOR redujo LVDd y HW, lo que sugiere que indujo atrofia cardíaca en la hipertrofia excéntrica establecida (Figura complementaria S3b-c).

Akt es la quinasa más conocida que media la activación de mTOR y se fosforila durante el VO6. Nuestros resultados revelaron que la fosforilación de Akt en Ser473 y de PRAS en respuesta al estrés diastólico de la pared fue consistente durante el VO (Fig. 4a). Además, se descubrió que la fosforilación de la señalización descendente de Akt y Akt (PRAS y S6) ocurre 1 a 3 h después de la creación de la FAV (Fig. 4b). Estos resultados sugieren que Akt participa en la activación de mTOR bajo VO.

Fosforilación y ubiquitinación de Akt en respuesta a VO.

( a ) Transferencia Western de lisados ​​​​celulares obtenidos de tejido cardíaco durante 4 semanas de VO, sondados para Akt y PRAS total y fosforilado. ( b ) Transferencia Western de lisados ​​​​celulares obtenidos del tejido cardíaco durante 3 h de VO, investigados para detectar los componentes indicados de la vía de señalización Akt-mTOR. (c) Expresión de Akt total y fosforilada en tejido cardíaco después de 2 h de VO (con tiempo de exposición prolongado). La mancha de la banda proteica sugiere una modificación postraduccional de los residuos de Akt. (d) Inmunoblot (IB) de K63-ubiquitina en inmunoprecipitados (IP) de lisados ​​de tejido cardíaco detectados con un anticuerpo contra Akt. Se utilizó GAPDH como control de carga.

El análisis de inmunotransferencia reveló además una ligera disminución en el nivel total de Akt bajo VO (Fig. 4b), lo que sugiere que Akt puede estar sujeto a modificaciones postraduccionales en estas condiciones. Con una exposición más prolongada de la membrana, se observó mancha de la banda de Akt en las muestras de corazón cargadas diastólicamente para Akt total y fosforilado, lo que indica una modificación postraduccional de los residuos de Akt (Fig. 4c).

Además de la fosforilación, se sabe que la modificación postraduccional de Akt incluye O-GlcNAcilación y ubiquitinación25,26,27. Se requiere la ubiquitinación ligada a K63 para el reclutamiento de la membrana y la posterior fosforilación de Akt. Por lo tanto, examinamos la ubiquitinación K63 de Akt durante VO y encontramos que Akt fue modificada por la ubiquitinación K63 bajo VO (Fig. 4d). En conjunto, estos resultados indicaron que tanto la ubiquitinación de K63 como la fosforilación de Akt podrían desempeñar un papel clave en la activación de mTOR durante el VO.

Para evaluar si Akt media el estrés diastólico de la pared a través de la activación de mTOR, utilizamos el inhibidor alostérico MK-2206, que se dirige al dominio de homología de pleckstrina (PH) y previene el reclutamiento de Akt en la membrana celular28,29. Se ha demostrado que MK-2206 tiene una alta especificidad para Akt y un efecto mucho menor sobre mTOR y p70S6 K30. La fosforilación de Akt se observó por primera vez 10 minutos después de la creación de la FAV (Figura complementaria S4a) y persistió hasta 3 h después de la creación de la FAV (Figura 4b). En ratones a los que se les administró MK-2206 por vía oral (120 mg / kg), la fosforilación de Akt y S6 se inhibió entre 4 y 16 h y entre 8 y 20 h después de la administración, respectivamente (Figura complementaria S4b). Por lo tanto, la FAV se creó 6 h después de la administración de MK-2206 y las muestras de miocardio se recogieron 2 h después de la creación de la FAV. La fosforilación de Akt ubiquitinado y no ubiquitinado fue inhibida por el tratamiento con MK-2206 y la fosforilación de S6 se suprimió concomitantemente, lo que sugiere que la ubiquitinación, el reclutamiento de membrana y la fosforilación de Akt son necesarios para la activación de mTOR bajo VO (Fig. 5a). Además, la activación de mTOR en el día 3 de VO fue completamente inhibida por MK-2206 (Fig. 5b). Estos resultados sugirieron que Akt es un mediador clave de la activación de mTOR inducida por estrés mecánico durante el VO.

Papel de Akt en la activación de mTOR durante el VO.

( a ) Transferencia Western de lisados ​​​​celulares obtenidos de tejido cardíaco después de 2 h de VO después de 6 h de pretratamiento con MK-2206, sondados para Akt y S6 total y fosforilado (con un tiempo de exposición prolongado a la membrana). (b) Análisis de transferencia Western de Akt y S6 total y fosforilado 8 h después de la administración de MK-2206 el día 3 de VO. ( c ) Transferencia Western de lisados ​​​​celulares obtenidos del ventrículo derecho (VD) y de las aurículas derecha e izquierda (RA y LA, respectivamente) el día 3 de VO, sondados para Akt y S6 total y fosforilado. Se utilizó GAPDH como control de carga.

En el modelo de VO utilizado en este estudio, la FAV indujo el VO no sólo en el ventrículo izquierdo, sino también en las aurículas derecha e izquierda y en el ventrículo derecho. Por lo tanto, investigamos la señalización de Akt-mTOR en estas cámaras y encontramos que la señalización de Akt-mTOR se activó durante el VO y se bloqueó completamente por MK-2206, lo que indica que el papel de la señalización de Akt-mTOR en la hipertrofia excéntrica durante el VO es común a todas las cámaras de el corazón (Fig. 5c).

Para identificar activadores de Akt, la expresión de varios factores de crecimiento, incluido el factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) -1 y -2, la neuregulina (NRG) -1, el factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF) y el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) -A, -B, -C y -D. La expresión de NRG-1, IGF-2 y CTGF aumentó significativamente el día 1 después de la creación de la FAV, la de IGF-1, IGF-2, NRG-1, CTGF y PDGF-C aumentó significativamente el día 7 y la de CTGF. , PDGF-B y PDGF-D el día 14 (Fig. 6). Estos resultados sugirieron la posibilidad de que varios factores de crecimiento estén involucrados en la activación de Akt-mTOR durante el VO.

Expresión genética de varios factores de crecimiento durante la VO.

La expresión de IGF, NRG, CTGF y PDGF se cuantificó mediante RT-qPCR y se normalizó con respecto a la expresión del gen 18S rRNA. Los datos se muestran como la media ± SEM (n = 4). *P < 0,05, **P < 0,01 frente al día 0 (prueba de Dunnett).

mTOR se conoce como la quinasa limitante de la tasa de crecimiento de células y órganos19,20. Ajustamos la tendencia de HW durante VO usando el software Excel (Figura complementaria S5a) y volvimos a muestrear 28 puntos de la curva ajustada usando Graphcel v1.11 (Figura complementaria S5b). Luego calculamos la diferencia entre puntos remuestreados consecutivos (Figura complementaria S5c), que correspondía a la tasa de progresión de la hipertrofia excéntrica por día. Este análisis detallado reveló que la tendencia de la tasa de progresión durante el VO es similar a la de cada promedio (n = 2) de actividad mTOR (Figura complementaria S5d), lo que sugiere que la actividad mTOR determina linealmente la tasa de progresión de la hipertrofia excéntrica. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la tasa de aumento de HW (v mg/unidad de tiempo) durante el VO es proporcional a la actividad de mTOR como v = α × actividad de mTOR (donde α es una constante apropiada). Por lo tanto, la integración temporal de v produce HW de la siguiente manera:

donde HW(0) es el HW inicial (=110) y mTOR (t) es la actividad mTOR que varía en el tiempo.

Trazamos los puntos en cada promedio de actividad mTOR (n = 2) durante el VO en un gráfico y conectamos cada punto, como se muestra en la figura complementaria S5d, y se volvieron a muestrear 100 puntos de datos por día. Los datos remuestreados reprodujeron con precisión la actividad mTOR medida experimentalmente (Fig. 7a). Resolvimos la ecuación (1) con el programa Simulink (Fig. 7b). La curva HW estimada se aproximaba bien a la curva HW medida experimentalmente (Fig. 1b y Fig. 7c). Además, los valores absolutos del HW estimado coincidieron bien con los medidos, si se proporcionó la constante apropiada (α = 0,001) (Fig. 7d). Estos resultados proporcionaron pruebas sólidas de que la actividad mTOR es proporcional a la tasa de progresión de la hipertrofia excéntrica durante el VO.

Estimación de la progresión de la hipertrofia excéntrica durante el VO.

(a) Curva reproducida de la actividad de mTOR durante el VO a partir de puntos de datos remuestreados. (b) Diagrama esquemático para estimar HW a partir de la serie temporal de actividad mTOR (relación pS6/S6) durante VO. (c) HW estimado durante VO cuando α = 0,001. (d) Correlación entre HW medido y estimado. Los datos se muestran como la media ± SEM (n = 4).

Además, encontramos que la relación matemática entre el estrés diastólico de la pared (σ) y la actividad mTOR era la siguiente (Fig. 2b):

Sustituyendo la actividad mTOR en la ecuación (2) en (1) y σ con d × p/4h se obtuvo eHW de la siguiente manera:

(Figura 8a). La ecuación 3 indica que, una vez que se determinan los parámetros fisiológicos d (LVDd) yp (LVEDP) para la estimación del estrés diastólico de la pared, se puede estimar con precisión la progresión de la hipertrofia excéntrica durante el VO. De hecho, los conjuntos de datos basados ​​en 100 puntos de datos remuestreados por día de LVEDP y LVDd reprodujeron los LVEDP y LVDd medidos experimentalmente (Fig. 8b) y permitieron una estimación precisa de la actividad mTOR mediante la ecuación (2) cuando el espesor medio de la pared (h) era aproximado por su valor promedio en el día 0 (= 0,70) (Fig. 8c), ya que no cambió significativamente durante el VO (Fig. 1e). Además, estimamos con precisión el HW durante el VO mediante la ecuación (3) (Fig. 8d), que reveló que eHW estaba estrechamente correlacionado con el HW medido cuando α = 0,001 (Fig. 8e). Estos resultados sugirieron que podríamos estimar la progresión de la hipertrofia excéntrica en ratones a partir de parámetros fisiológicos como LVEDP y LVDd.

Estimación de la hipertrofia excéntrica durante el VO utilizando parámetros fisiológicos LVEDP y LVDd.

(a) Diagrama esquemático para estimar HW a partir de LVEDP y LVDd. (b) Las curvas LVEDP (panel izquierdo) y LVDd (panel derecho) se reprodujeron con Simulink a partir de puntos de datos remuestreados. (c) Actividad mTOR estimada durante VO. (d) HW estimado durante el VO cuando α = 0,001. (e) Correlación entre HW medido y estimado. Los datos se muestran como la media ± SEM (n = 4).

Tres hallazgos principales surgieron del análisis del modelo VO tanto a nivel fisiológico como molecular: 1) mTOR, cuya actividad depende del estrés diastólico de la pared, es un regulador fundamental de la hipertrofia excéntrica durante el VO; 2) Akt es un mediador importante de la activación de mTOR tras el estiramiento mecánico en diástole; y 3) la tasa de progresión de la hipertrofia excéntrica durante el VO es proporcional a la actividad mTOR, lo que permite una estimación precisa de la progresión de la hipertrofia excéntrica basada en conjuntos de datos LVDd y LVEDP.

Hasta donde sabemos, este es el primer informe sobre la identificación precisa de la relación cuantitativa entre la DPVI como carga hemodinámica y la actividad mTOR durante el VO en el corazón y el papel de mTOR en la hipertrofia excéntrica. Algunos estudios previos se centraron en el papel de mTOR en el modelo PO y revelaron que mTOR se activaba en el corazón en este modelo22. Sin embargo, actualmente no hay evidencia de que la actividad mTOR esté correlacionada con la presión sistólica o el estrés de la pared sistólica, aunque la actividad mTOR aumentó temporalmente en la fase aguda de un modelo de constricción aórtica transversal (TAC)22. La constricción aórtica in vivo aumenta no sólo la presión sistólica sino también la DPVI porque un aumento agudo de la poscarga en el modelo de constricción aórtica inevitablemente reduce el gasto cardíaco y el aumento de la DPVI31. Además, no hay duda de que mTOR se activa en la fase crónica del modelo PO porque la PDFVI generalmente aumenta en la IC descompensada32. Estas interpretaciones podrían dilucidar por qué mTOR también se activa en el modelo PO. Demostramos que la actividad mTOR está estrechamente correlacionada con el estrés diastólico de la pared utilizando un modelo de VO, en el que no se observó ningún aumento en la presión sistólica. Estos resultados sugirieron que la actividad mTOR está regulada directamente por la DPVI y desempeña un papel clave en la hipertrofia excéntrica causada por el VO.

Demostramos que la inhibición de mTOR induce atrofia cardíaca y elimina por completo la hipertrofia excéntrica en ratones tratados con temsirolimus durante la VO en comparación con ratones operados de forma simulada tratados con temsirolimus. Es importante destacar que la inhibición de mTOR indujo atrofia cardíaca sin regulación positiva de genes atróficos como la atrogina-1 y la proteína muscular RING-finger (MuRF) -1, que funcionan como ubiquitina ligasas (Figura complementaria S6). Estos resultados indicaron que la masa o el tamaño del corazón estaba determinado por el equilibrio entre la síntesis y degradación de proteínas y que la atrofia cardíaca se producía cuando el equilibrio se inclinaba hacia la degradación de proteínas bajo la inhibición de mTOR incluso sin una regulación positiva de los genes atróficos, mientras que la hipertrofia excéntrica se producía cuando las proteínas síntesis bajo VO dominada.

Sin embargo, la causa de la muerte en ratones tratados con temsirolimus durante la VO no estaba clara porque estos animales estaban gravemente debilitados y murieron poco después de la administración del anestésico; por lo tanto, no pudimos medir la PDFVI para este grupo. Sin embargo, especulamos que el bajo gasto cardíaco del VI más pequeño daría como resultado una DPVI más alta y sería letal para los ratones operados con FAV tratados con temsirolimus porque la función sistólica, definida por los DVI y la FEVI determinados ecocardiográficamente, se conservó en todos los grupos.

El papel de mTOR en la hipertrofia del músculo esquelético es similar al de la hipertrofia excéntrica del corazón33,34. En el músculo esquelético, Akt es uno de los principales mediadores de la activación de mTOR inducida por el estiramiento mecánico33, mientras que otras señales que incluyen aminoácidos, Ca2+ y ácidos fosfatídicos también están involucradas34. Recientemente se ha informado que la vía neuronal del óxido nítrico sintasa (nNOS)/Ca2+/mTOR es una vía clave en la hipertrofia inducida por estiramiento del músculo esquelético16. Descubrimos que la inhibición de Akt por MK-2206 abolió la activación de mTOR durante el VO, lo que subraya su importancia como mediador clave de la señalización de mTOR, aunque esto no excluye la participación de otros factores.

Mientras tanto, el activador de Akt durante el VO aún no se ha aclarado definitivamente, aunque identificamos candidatos como IGF, NRG-1 y CTGF. NRG-1 se libera de las células endoteliales de los microvasos del corazón35 y el IGF se libera de los miocitos en respuesta al estiramiento mecánico36. Debido a que era técnicamente difícil investigar la secreción de estos factores de crecimiento in vivo durante la VO, medimos su expresión de ARNm en la fase subaguda (día 1 a 14). Por tanto, la contribución de estos factores de crecimiento a la activación de Akt-mTOR durante el VO, especialmente en la fase aguda (1-3 h), no es concluyente. Anteriormente se informó que los miocitos secretan rápidamente IGF-1 (en 30 minutos) en respuesta al estiramiento mecánico in vitro36; Por lo tanto, especulamos que la secreción de estos factores de crecimiento precedería a la regulación positiva del ARNm y contribuiría a la activación del eje Akt-mTOR en la fase aguda (1 a 3 h). Sin embargo, se necesita más investigación para confirmar el papel de los factores de crecimiento en la activación de Akt-mTOR durante el VO. Además, la ubiquitinación K63 de Akt en respuesta al VO puede contener una pista para la identificación del activador del eje Akt-mTOR. Informes recientes han indicado que el IGF y los factores de crecimiento epidérmico regulan la ubiquitinación de Akt en K63, lo que lleva a su reclutamiento en la membrana celular y promueve su fosforilación26,27. Nuestros resultados que indican la ubiquitinación de K63 son consistentes con la regulación positiva de IGF-1 o NRG-1 y la activación de Akt-mTOR. Valdría la pena investigar más a fondo el papel no solo de IGF-1 y NRG-1, sino también de la ubiquitinación de K63, en la activación de Akt-mTOR durante el VO. Además de IGF y NRG-1, CTGF, que anteriormente se había informado que activa Akt en miocitos neonatales aislados de rata, podría contribuir a la activación de Akt-mTOR durante VO37. Además de estos factores de crecimiento, investigamos la quinasa ligada a integrina (ILK), la quinasa de adhesión focal (FAK) y el receptor de proteína acoplado a proteína G (GPCR), pero no encontramos evidencia clara de su participación en la activación de Akt durante el VO (Figura complementaria. S7a-c).

Como mTOR juega un papel clave en el crecimiento de los órganos y determina el tamaño de los órganos11,19,21, la hipertrofia excéntrica, que depende principalmente de la actividad de mTOR, es análoga al crecimiento cardíaco y la actividad de mTOR regula fisiológicamente el tamaño del corazón adulto de acuerdo con la capacidad del individuo. físico y el correspondiente volumen estresado (precarga). Además de su papel en el crecimiento cardíaco, el eje Akt-mTOR desempeña un papel clave en la hipertrofia inducida por el ejercicio38,39. El ejercicio no sólo induce una mayor contractilidad y un aumento de la frecuencia cardíaca, sino también una reducción de la resistencia arterial y un aumento del volumen estresado (precarga) con un leve aumento de la PDFVI40,41. Especulamos que el aumento en el volumen estresado y la DPVI durante el ejercicio activaría Akt-mTOR, lo que resultaría en hipertrofia inducida por el ejercicio, a pesar de que el ejercicio produce una estimulación compuesta para el corazón como se mencionó anteriormente.

Demostramos que el HW durante el VO podría estimarse con precisión mediante la integración temporal de la actividad de mTOR basándose en la evidencia de que la tasa de progresión de la hipertrofia excéntrica era proporcional a la actividad de mTOR, lo que subraya el papel fundamental de mTOR en la hipertrofia excéntrica. Una razón por la cual este simple cálculo permite una estimación precisa del HW durante el VO2 podría ser la baja capacidad proliferativa de los miocitos. Para otros órganos, se requeriría un modelo más complejo porque la presencia de células proliferativas produciría un aumento de masa independiente del crecimiento celular resultante de la actividad mTOR.

Aunque en este estudio nos centramos en el papel de Akt-mTOR en la hipertrofia excéntrica, el papel de Akt-mTOR en la función cardíaca también es un tema interesante. Akt desempeña un papel clave en la vía de supervivencia a través de diversas señales42,43 y mTORC1 regula la función cardíaca y la supervivencia de los miocitos a través de la inhibición de 4E-BP144. Nuestros datos preliminares mostraron que la apoptosis de miocitos no era evidente en la hipertrofia excéntrica durante el VO como se informó anteriormente6 (Figura complementaria S8) y, por lo tanto, no investigamos más a fondo el papel del eje Akt-mTOR en la función cardíaca en este estudio; sin embargo, sería de gran interés investigar el papel del eje Akt-mTOR en respuesta al estrés diastólico de la pared en la función cardíaca en el miocardio defectuoso, en el que con frecuencia ocurre la apoptosis de los miocitos.

En conclusión, el eje Akt-mTOR, que se activa de manera dependiente de la DPVI, desempeña un papel fundamental en la progresión de la hipertrofia excéntrica. Como la hipertrofia excéntrica es un sistema inherente del corazón para regular el gasto cardíaco y la DPVI, nuestros hallazgos proporcionan una nueva visión mecanicista del mecanismo adaptativo del corazón.

Todos los procedimientos relacionados con animales y los protocolos de cuidado de animales fueron aprobados por el Comité de Ética de Experimentos con Animales de la Escuela de Graduados en Ciencias Médicas y Farmacéuticas de la Universidad de Kyushu (A26-053) y se realizaron de acuerdo con las Directrices para Experimentos con Animales de la Universidad de Kyushu y la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio publicada por los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. (revisada en 2011). Se alojaron ratones C57BL/6J (comprados en Kyudo Co. Ltd., Saga, Japón) en una habitación con temperatura y humedad controladas y se les alimentó con una dieta comercial (CRF-1; Oriental Yeast Co. Ltd., Tokio, Japón). con libre acceso al agua. El modelo VO se generó mediante la creación de una FAV como se describió anteriormente45. Brevemente, se anestesiaron ratones macho de 8 a 10 semanas de edad con una mezcla de medetomidina (0,3 mg/kg; Wako Chemicals, Osaka, Japón), midazolam (4 mg/kg; Wako Chemicals) y tartrato de butorfanol (5 mg/kg). kg; Wako Chemicals) según las recomendaciones institucionales, o con 1,5–2% de isoflurano (Pfizer, Nueva York, NY, EE. UU.) más tartrato de butorfanol (5 mg/kg; Wako Chemicals) para experimentos dentro de las 24 h. Se cortó la aorta abdominal y se penetró desde el lado arterial al venoso con una aguja y el orificio en el lado arterial se selló con cianoacrilato. Antes del cierre de la incisión abdominal, a los ratones se les administró por vía intraperitoneal 0,2 ml de solución salina normal para reponer la pérdida de líquido debido a la hemorragia. La creación exitosa de la FAV se confirmó observando sangre arterial roja oxigenada en la vena en el momento de la cirugía y en el momento del sacrificio. Los ratones de control se sometieron a una cirugía simulada sin creación de FAV. Los ratones permanecieron hambrientos durante más de 12 h antes del sacrificio.

Bajo anestesia ligera con isoflurano al 1-2%, se obtuvieron imágenes bidimensionales en modo M dirigidas desde la vista del eje corto al nivel del músculo papilar utilizando un sistema de ecografía Vevo 2100 (Visual Sonics, Toronto, Canadá). La FEVI se calculó mediante la siguiente fórmula que estaba preprogramada en el sistema: FEVI = [(volumen del VI diastólico—volumen del VI sistólico)/volumen del VI diastólico) × 100], donde volumen del VI = [(7,0/(2,4 + VI diámetro)] × diámetro del VI 3. El espesor medio de la pared se midió como el valor medio de los espesores del tabique interventricular y la pared posterior del ventrículo izquierdo. La hemodinámica se midió mientras los ratones estaban ligeramente anestesiados con tribromoetanol-hidrato de amileno (2,5% Avertin; 8 μL/g de peso corporal mediante inyección intraperitoneal; Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.). Se insertó un catéter con punta de micromanómetro de 1,4 Fr (Millar Instruments Inc., Houston, TX, EE. UU.) en la arteria carótida derecha y La tensión diastólica de la pared (σ) se calculó a partir del diámetro del VI en diástole (LVDd) (d), el espesor medio de la pared (h) medido por ecocardiografía y la DPVI (p) de acuerdo con la fórmula σ. = d × p/4 h, asumiendo una geometría esférica.Después de las mediciones, los ratones fueron sacrificados con una sobredosis de fenobarbital sódico.

Se homogeneizaron muestras de tejido de miocardio congeladas en tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) que contenía un cóctel inhibidor de proteasa (Roche Diagnostics, Indianápolis, IN, EE. UU.), NaF 1 mM y Na3VO4 0,1 mM. Se separaron cantidades iguales de proteína (20 μg por carril) mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) y luego se transfirieron electroforéticamente a una membrana de nitrocelulosa utilizando un aparato Trans-Blot (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.) . Después de bloquear durante 1 h con leche desnatada en solución salina tamponada con Tris con Tween 20 al 0,1%, la membrana se incubó con el anticuerpo primario a 4 °C durante la noche, seguido de la incubación con el anticuerpo secundario apropiado a temperatura ambiente durante 1 h. Se utilizaron anticuerpos primarios de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EE. UU.) contra las siguientes proteínas: proteína ribosomal S6 (#2217), fosfo-S6Ser235/236 (#4858), fosfo-S6240/244 (#5364), traducción eucariota proteína de unión al factor de iniciación 4E (4E-BP; #9644), fosfo-4E-BPThr37/46 (#2855), Akt (#9272), fosfo-AktSer473 (#4060), sustrato de Akt rico en prolina de 40 kDa (PRAS40; #2691), fosfo-PRASThr246 (#13175), ubiquitina específica de enlace K63 (#5621), caspasa-3 escindida (#9661) y poli ADP ribosa polimerasa (PARP; #9542). Se utilizó como control un anticuerpo contra la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GADPH; sc-32233; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE. UU.).

Los homogeneizados de tejido de miocardio se inmunoprecipitaron con anticuerpo Akt (n.º 9272) en tampón RIPA que contenía un cóctel de inhibidor de proteasa, NaF 1 mM, Na3VO4 0,1 mM y PR-619 20 μM a 4 °C durante 1 h. Se agregaron perlas de proteína G-sefarosa (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, EE. UU.) a la mezcla y se incubaron a 4 °C durante 1 h. La mezcla se centrifugó y se lavó tres veces. A cada muestra se añadió un volumen equivalente de tampón de muestra. Después de agitar y hervir, se separaron volúmenes iguales de las muestras mediante SDS-PAGE, seguido de inmunotransferencia como se describe anteriormente.

Se implantaron por vía subcutánea en los ratones bombas osmóticas (ALZET, Cupertino, CA, EE. UU.) llenas de solución de temsirolimus (Pfizer, Nueva York, NY, EE. UU.). El inhibidor de Akt MK-2206 (Active Biochemicals Co., Hong Kong) se disolvió en captisol al 30% (ChemScene, Monmouth Junction, Nueva Jersey, EE. UU.) y se administró por vía oral. A los ratones de control se les administró el vehículo.

El ARN total se extrajo con el kit RNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA, EE. UU.) y se convirtió en ADNc utilizando un kit ReverTra Ace (Toyobo, Tokio, Japón). La expresión relativa de cada gen diana se midió mediante RT-qPCR a partir de ADNc equivalente a 10 ng de ARN utilizando 12 pmol de cada cebador en un volumen de reacción de 30 μl. Las reacciones se realizaron en un sistema de PCR en tiempo real rápido AB7500 (Life Technologies, Rockville, MD, EE. UU.). Se utilizó el gen de ARN ribosómico 18S como control interno. Las secuencias de los cebadores directo e inverso, respectivamente, fueron las siguientes: IGF-1, CTGGACCAGAGACCCTTTGC y GGACGGGGACTTCTGAGTCTT; IGF-2, GTG CTGCATCGCTGCTTAC y ACGTCCCCTCTCGGACTTGG; NRG-1, GGCATCTGTATCGCCCTGTTG y TGAGGGCCATTCGCTATGTTC; CTGF, TGCAGACTGGAGAAGCAGAG y CGATTTTAGGTGTCCGGATG; PDGF-A, GCGACTCTTGGAGATAGACTCCGTA y CGTAATGACCGTCCTGGTCTTG; PDGF-B, TGCTGAGCGACCACTCCATC y CTCGGGTCATGTTCAAGTCCA; PDGF-C, ACCCGGATTCTGCATCCACTAC y GTCCACCTGCCATCGATCTG; PDGF-D, GCGGAACTGTCAACTGGAAGTC y CTCTTGAAATGTCCAGGCTCAAAC; atrogina-1, AACATGTGGGTGTATCGGATGG y TGATGTTCAGTTGTAAGCACACAGG; MuRF-1, TGTCTCACGTGTGAGGTGCCTA y CACCAGCATGGAGATGCAGTTAC; y 18S, TTCTGGCCAACGGTCTAGACAAC y CCAGTGGTCTTGGTGTGCTGA.

Se utilizó el software Simulink (MathWorks, Natick, MA, EE. UU.) para realizar una simulación con las series temporales de actividad mTOR, LVEDP y LVDd. Ajustamos linealmente o en curva los datos medidos de actividad mTOR, LVDd y LVEDP usando el software Excel (Microsoft, Redmond, WA, EE. UU.) y las curvas ajustadas se volvieron a muestrear a 100 puntos/día usando el software en línea Graphcel v1.11 para adquirir un conjunto de datos para cada parámetro que luego se utilizó como datos de entrada para el modelo de simulación.

Los datos se muestran como la media ± SEM. Para comparar los grupos de tratamiento, utilizamos un análisis de varianza unidireccional (ANOVA unidireccional) seguido de la prueba post-hoc de Tukey o Dunnett. El análisis de supervivencia se realizó utilizando el método de Kaplan-Meier y las diferencias en supervivencia entre grupos se evaluaron con la prueba de rangos logarítmicos. P <0,05 se consideró significativo. Para el análisis estadístico se utilizó el software JMP9 (SAS, Cary, NC, EE. UU.).

Cómo citar este artículo: Ikeda, M. et al. El eje Akt-mTOR es un regulador fundamental de la hipertrofia excéntrica durante la sobrecarga de volumen. Ciencia. Rep. 5, 15881; doi: 10.1038/srep15881 (2015).

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Agradecemos a K. Hirano por su asesoramiento técnico y reconocemos el apoyo técnico del Centro de Apoyo a la Investigación de la Escuela de Graduados en Ciencias Médicas de la Universidad de Kyushu. Este trabajo fue apoyado por JSPS KAKENHI (Subvenciones Número 25670392, 24390198, 23220013 y 23591084), los Fondos Estratégicos para la Promoción de la Ciencia y la Tecnología del Ministerio de Cultura, Deportes, Ciencias y Tecnología y las Subvenciones para la Investigación Científica de el Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar de Japón.

Departamento de Medicina Cardiovascular, Escuela de Graduados en Ciencias Médicas, Universidad de Kyushu, Fukuoka, Japón

Masataka Ikeda, Tomomi Ide, Takeo Fujino, Yuka Matsuo, Shinobu Arai, Keita Saku, Takamori Kakino, Yasuhiro Oga, Akiko Nishizaki y Kenji Sunagawa

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MI, TF, YM, SA, KS, TK, YO y AN realizaron los experimentos. MI y TI diseñaron los experimentos y prepararon el manuscrito. KS supervisó el proyecto.

Los autores no declaran tener intereses financieros en competencia.

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Reimpresiones y permisos

Ikeda, M., Ide, T., Fujino, T. et al. El eje Akt-mTOR es un regulador fundamental de la hipertrofia excéntrica durante la sobrecarga de volumen. Representante científico 5, 15881 (2015). https://doi.org/10.1038/srep15881

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Recibido: 10 de junio de 2015

Aceptado: 01 de octubre de 2015

Publicado: 30 de octubre de 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep15881

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