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Dec 12, 2023

Métodos para capturar firmas proteómicas y metabolómicas del líquido cefalorraquídeo y suero de individuos sanos.

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 13339 (2022) Citar este artículo 1176 Accesos 2 Citas 1 Detalles de Altmetric Metrics Descubrimiento de firmas confiables para el diagnóstico empírico de

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 13339 (2022) Citar este artículo

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El descubrimiento de firmas fiables para el diagnóstico empírico de enfermedades neurológicas, tanto infecciosas como no infecciosas, sigue sin realizarse. Uno de los principales desafíos encontrados en tales estudios es la falta de una base de datos completa que represente los antecedentes característicos que existen en individuos sanos y con los que se pueda evaluar un evento aberrante. En el caso de lesiones y lesiones neurológicas, es importante comprender el perfil normal de los fluidos neuronal (líquido cefalorraquídeo) y sistémico (p. ej., sangre). Aquí, presentamos la primera base de datos humana multiómica comparativa de firmas derivadas de una población de 30 individuos (15 hombres, 15 mujeres, 23 a 74 años) de suero y líquido cefalorraquídeo. Además de las firmas empíricas, también asignamos vías comunes entre el suero y el LCR. En conjunto, nuestros hallazgos proporcionan una cohorte con la que se pueden evaluar perfiles característicos aberrantes en personas con lesiones o enfermedades neurológicas, lo que proporciona una vía para el descubrimiento de diagnósticos y terapias integrales.

Los insultos o lesiones al cuerpo, mediados por una variedad de afecciones no infecciosas, como enfermedades neurodegenerativas, accidentes cerebrovasculares y traumatismos craneoencefálicos por objetos contundentes, modifican la función fisiológica y bioquímica normal1,2,3,4. La identificación de patrones de firma específicos que reflejen el insulto o lesión puede facilitar el desarrollo de diagnósticos empíricos y terapias dirigidas5. Por ejemplo, el diagnóstico actual de lesión cerebral traumática (LCT) leve se basa en cuestionarios neuropsicológicos y estrategias de imágenes para la identificación cualitativa6,7. La eficacia de estos diagnósticos está limitada por la presentación variada del estado de la enfermedad, la aparición tardía de los síntomas, las comorbilidades, la historia clínica y la presentación diferencial a largo plazo, una limitación que puede superarse mediante la disponibilidad de diagnósticos empíricos.

La derivación de firmas diagnósticas empíricas para un estado patológico determinado requiere una comprensión a nivel de sistemas de los procesos involucrados. La revolución ómica ha permitido análisis de genes, proteínas y metabolitos más rápidos, más baratos y de mayor rendimiento, lo que facilita la identificación de nuevos objetivos para una variedad de enfermedades8,9. Mientras que el genoma es relativamente resistente a las influencias ambientales externas, el proteoma y el metaboloma humanos son más susceptibles al medio ambiente y a las lesiones, lo que los convierte en firmas ideales para el desarrollo de diagnósticos (Fig. 1a). Los estudios multiómicos han llevado a la identificación de varios biomarcadores asociados con una variedad de enfermedades como la TCE10,11,12,13. Sin embargo, el desarrollo generalizado del diagnóstico clínico a partir de dichos estudios se ha visto limitado debido a la variabilidad intrínseca en los perfiles de biomarcadores observados. Una de las principales limitaciones que obstaculiza la traducción clínica de los observables multiómicos es que los patrones de biomarcadores asociados con una enfermedad/lesión no son casos de simple presencia/ausencia, sino que deben combinarse con una concentración umbral en la muestra de interés (p. ej., sangre, líquido cefalorraquídeo u orina). Es difícil determinar ese umbral sin una línea de base confiable en condiciones saludables. Esta línea de base debería tener en cuenta la variabilidad de un biomarcador determinado entre los individuos de una población (p. ej., edad/sexo). Además, incluso dentro de un individuo, el perfil de biomarcadores medido es una "instantánea" del estado bioquímico actual y variará con el tiempo en respuesta a influencias externas14. La disponibilidad de perfiles característicos sistemáticos, confiables y de referencia de individuos sanos que tengan en cuenta la variabilidad inter e intraindividual es esencial para evaluar y caracterizar la expresión de biomarcadores específicos de la enfermedad15. El trabajo presentado aquí pretende avanzar un paso más en esa dirección.

(a) Jerarquía de ómicas donde el metaboloma y el proteoma son temporalmente más sensibles a la influencia ambiental, como enfermedades y lesiones. (b) Esquema de adquisición y procesamiento de muestras para proteómica (izquierda) y metabolómica (derecha). Las muestras de LCR (iconos azules) se extrajeron mediante punción lumbar (S1-L5) y las muestras de suero (iconos rojos) se extrajeron mediante punción venosa. El procesamiento proteómico sigue el flujo de trabajo de la izquierda con liofilización (1P), resuspensión y solubilización (2P), las proteínas se adhirieron a la columna S-Trap (3P), las proteínas fijadas se lavaron (4P), las proteínas se digirieron durante la noche con tripsina (5P). , los péptidos se eluyeron (6P), se secaron y se suspendieron para análisis LC-MS/MS (7P). El procesamiento metabolómico sigue el flujo de trabajo correcto mediante extracción y separación con disolventes orgánicos (1 M), seguido de concentración y resuspensión (2 M) para análisis GC-MS (3 M). C) Desglose por edad/sexo de las 30 muestras de LCR y 30 de suero.

El cerebro es el órgano más rico en lípidos y consume alrededor del 20% de la energía total del cuerpo16,17. Por lo tanto, las agresiones y lesiones cerebrales (por ejemplo, TBI) y la interrupción asociada del suministro de sangre pueden generar una crisis metabólica que, si no se resuelve, puede aumentar la atrofia cerebral y empeorar los resultados18. Cuando se altera, el LCR se filtra a la sangre, por lo que los biomarcadores normalmente exclusivos del cerebro pero que se encuentran en la sangre pueden proporcionar información sobre el estado bioquímico de la lesión y la enfermedad. Sin embargo, existen estudios exhaustivos limitados (el único informe publicado actualmente por Dayon et al.) que comparan simultáneamente los perfiles proteómicos y metabolómicos de muestras de LCR y suero compatibles en pacientes individuales19. Tales comparaciones se complican por el hecho de que el perfil de firma multiómico comparativo nativo del LCR y el suero en individuos sanos no está bien definido. Además, el LCR es un líquido altamente dinámico y la adquisición de muestras puede dar resultados variados dependiendo de si el LCR se obtiene del líquido cefalorraquídeo o directamente mediante una derivación del sistema ventricular20.

En este documento, presentamos un estudio proteómico y metabolómico comparativo de LCR/suero de 30 individuos sin condiciones o dolencias neurológicas adversas previamente documentadas, para aliviar algunos de los desafíos anteriores asociados con el descubrimiento de biomarcadores para lesiones neurológicas. La Figura 1b detalla la recolección de muestras y el procesamiento de muestras de suero separadas de la sangre recolectadas mediante venopunción y las muestras de LCR se recolectaron mediante punción lumbar (vértebra L1-S1). Se procesaron alícuotas de estos LCR/suero coincidentes para determinar perfiles proteómicos y lipidómicos. Nuestra población estaba formada por 15 mujeres y 15 hombres con edades comprendidas entre 23 y 74 años (Fig. 1c).

En el descubrimiento de biomarcadores, el agotamiento de proteínas de alta abundancia como inmunoglobulinas y albúmina (dg/L) para facilitar el examen de proteínas de menor abundancia (ng/L)21,22,23,24,25. Sin embargo, en nuestros experimentos iniciales de alcance, encontramos que estos procedimientos de agotamiento contribuyeron a una alta variación en el proteoma detectado, tanto en mediciones repetidas de una muestra determinada como entre muestras similares. Por lo tanto, optamos por sacrificar la sensibilidad para detectar de manera confiable proteínas en concentraciones muy bajas para reducir la variabilidad en los perfiles proteómicos medidos. Las proteínas se limpiaron y digirieron en una columna S-Trap y luego se analizaron mediante LC-MS/MS en una plataforma Thermo Scientific Fusion Lumos que se ejecuta en modo de adquisición independiente de datos (DIA) (Fig. 1b). Las muestras de la biblioteca de cromatogramas se buscaron individualmente en las bases de datos predichas de Prosit y se convirtieron para ScaffoldDIA utilizando una biblioteca espectral de referencia creada en EncyclopeDIA v.0.9.2 (detalles en los Métodos). Las proteínas se identificaron con una tasa de descubrimiento falso (FDR) del 10 % y un mínimo de un péptido.

En estas condiciones, identificamos 813 proteínas en suero y 932 en LCR. Además, ambas muestras compartieron 801 proteínas, 12 proteínas eran exclusivas del suero y 131 del LCR. La intensidad de los iones fragmentados se utilizó para medir la abundancia relativa entre el LCR y el suero. La variación total en la intensidad entre las proteínas de las muestras combinadas de LCR y suero se descompuso mediante Análisis de Componentes Principales (PCA). Ese análisis reveló que las mayores contribuciones a la varianza de la muestra combinada es la etiqueta de la muestra, LCR versus suero, que explica el 56% de la varianza total (Fig. 2a). En contraste, el segundo componente principal solo explicó una pequeña fracción de la varianza total (2%). La Figura 2b ilustra las diferencias relativas en la abundancia media de proteínas entre el LCR y el suero (eje x) en función de sus valores p ajustados de Benjamini-Hochberg asociados (eje y). Cada punto de la figura representa una de las 801 proteínas identificadas en el LCR/suero. 317 proteínas fueron significativamente más abundantes en el LCR, con una diferencia de intensidad diez veces mayor. En comparación, 83 proteínas eran significativamente más abundantes en el suero con una diferencia de intensidad diez veces o más. En este estudio, demostramos explícitamente cómo cambiar el FDR cambia la cobertura de proteínas única entre el suero y el LCR (Fig. 2c, lista completa en S1-S2). La cantidad de proteínas únicas para cada tipo de muestra disminuye sustancialmente al aumentar la FDR. Elegimos un FDR del 10% para este estudio porque equilibraba la sensibilidad y la precisión predictiva.

( a ) Análisis de componentes principales de datos proteómicos de proteínas séricas (rojas) y proteínas del LCR (azul), donde cada punto es una muestra. (b) Gráfico de volcán de datos proteómicos donde el log10 de la intensidad de cada proteína versus el valor p corregido de log10, las líneas grises discontinuas verticales representan un cambio de +/- diez veces y la línea discontinua horizontal es p = 0,05. (c) Tabla que describe cómo las proteínas incluidas en el análisis varían según la tasa de FDR. (d) Análisis de componentes principales de datos metabolómicos. (e) Gráfico volcánico de datos metabolómicos. (f) Mapa de calor de los metabolitos cubiertos en el análisis; los metabolitos a la derecha de la línea negra representan los metabolitos identificados positivamente. rLa escala de 0 a 100 en el mapa de calor representa el porcentaje normalizado de detección en LCR o suero.

Comprender los perfiles metabolómicos básicos en condiciones sanas y sin lesiones puede ayudar a respaldar la relación normal de las firmas metabólicas entre el suero y el LCR en un individuo determinado. Aquí, detallamos el primer metaboloma comparativo de LCR/suero humano emparejado. Los metabolitos se extrajeron con metiltertbuil éter y metanol, se separaron de las proteínas y se derivatizaron para el análisis GC-TOF MS utilizando un GC Agilent 6890 y un Pegasus III TOF MS (detalles completos en los Métodos)26. Los metabolitos se identificaron y cuantificaron utilizando BinBase v 4.027,28,29. Se identificaron un total de 613 metabolitos en todas las muestras. BinBase analiza los datos en función de FDR, por lo tanto, comparamos LCR/suero en términos de abundancia relativa de MS. Para ello, aplicamos procedimientos estadísticos similares a los descritos para las proteínas identificadas (PCA y pruebas t). La Figura 2d ilustra las coordenadas de los dos primeros componentes principales de las muestras. De manera similar a los resultados anteriores, el primer componente principal explicó gran parte de la varianza total (58%). Esta variación también pareció deberse en gran medida a las diferencias entre los tipos de muestras (LCR frente a suero). El segundo principal explicó sólo el 6% de la variación total. 29 metabolitos fueron significativamente (> 10 veces) más abundantes en el LCR, mientras que 110 metabolitos fueron significativamente (> 10 veces) más abundantes en el suero (Fig. 2e). Las bases de datos de metabolómica son inmaduras, por lo que la cantidad de metabolitos que se pueden asignar positivamente representa una pequeña fracción del número total de compuestos detectados. La Figura 2f ilustra la pequeña fracción (182) de metabolitos detectados a los que se les podría asignar una identidad compuesta. En S5 se puede encontrar una lista completa anotada de los metabolitos identificados y de BinBase.

Se evaluó el impacto de la edad y el sexo sobre las variaciones en los perfiles proteómicos y metabolómicos. Para ello, se realizó un análisis de componentes principales (en los primeros 10 componentes) del proteoma y el metaboloma, evaluando las diferencias entre el LCR y el suero mapeados en cada individuo. La agrupación jerárquica de individuos en Ward reveló dos subgrupos dentro del proteoma y el metaboloma del LCR entre individuos sanos. El examen de la demografía de los individuos de estos subgrupos muestra que diferían según la edad (Fig. 3a, c). Para el proteoma del LCR, los dos grupos tenían un promedio de 39 años y 52 años de edad, respectivamente (p = 0,04), mientras que para el metaboloma los grupos tenían un promedio de 37 frente a 53 años (p = 0,005). Si bien la pertenencia a un subgrupo en el proteoma y el metaboloma está fuertemente relacionada positivamente, hay individuos cuya asignación de subgrupo es discordante (Fig. 3b, d). Las proteínas neuronales notables que difieren según la edad incluyen la apolipoproteína E, la pentraxina neuronal-1 y el reticulón-4. En el SI se puede encontrar una tabla que comprende las proteínas individuales (S3) y los metabolitos (S4) que difieren entre los grupos.

(a) Diagrama de agrupamiento de la proteómica del LCR, cada punto representa un individuo agrupado en los componentes principales con agrupamiento jerárquico de Ward. La línea roja indica dónde se cortó el árbol para formar racimos. Las ramas más largas representan separaciones más grandes entre grupos de individuos. (b) Gráfico de edad del violín en términos de grupos proteómicos del LCR. (c) Diagrama de agrupamiento del metaboloma del LCR, cada punto representa un individuo agrupado en los componentes principales con agrupamiento jerárquico de Ward. La línea roja indica dónde se cortó el árbol para formar racimos. (d) Gráfico de violín de la edad en términos de grupos de metabolómica del LCR (e) Tabulación cruzada de la membresía proteómica y metabolómica del LCR.

Varios biomarcadores y procesos fisiológicos se han implicado en la patología de las agresiones y lesiones neuronales. Sin embargo, muchas de estas firmas se expresan en células sanas, aunque en concentraciones diferentes a las de las dañadas. En esta sección, examinamos la distribución relativa de algunas de estas firmas en LCR y suero sanos, para establecer una línea de base para su expresión y la consiguiente extrapolación del cambio en insultos y lesiones. Específicamente, comparamos las intensidades de EM entre apolipoproteínas (Fig. 4a) y neuroproteínas importantes en el LCR y el suero (Fig. 4b)10,30. Las apolipoproteínas, particularmente la Apo-E (P02649), están implicadas en una variedad de enfermedades, desde cardiovasculares, neurodegenerativas y TBI31,32. No encontramos diferencias significativas en estas proteínas según el género de los individuos encontrados en otro informe moderno33. La Apo-E se produce en el hígado por los hepatocitos y en el cerebro, y es la séptima proteína principal del LCR. De hecho, encontramos que Apo-E se expresa en una abundancia significativamente (10 veces mayor) en el LCR que en el suero (Fig. 4a). Los amiloide sérico A1, A2 y A4 (SAA) (P0DJI8, P0DJI9, P35542) son apolipoproteínas expresadas constitutivamente que cambian su expresión en respuesta a la inflamación inducida por citoquinas (IL-1, IL-6, IL-8 y TNFα). Se ha implicado que estas proteínas varían durante el curso de la LCT, en función del género y con cohortes más grandes19,34. De acuerdo, nuestros hallazgos indican que los niveles constitutivos de SAA son más altos en suero que en LCR, como se esperaba para individuos sanos. Sin embargo, a diferencia de otros hallazgos, no encontramos diferencias iniciales en los SAA entre hombres y mujeres. Una comparación adicional de Apo-A, Apo-B y Apo-C reveló tendencias esperadas de concentraciones iniciales más altas en suero que en el LCR, donde estas proteínas están asociadas con lipoproteínas del huésped como HDL, LDL y VLDL. Otros marcadores relevantes de lesiones y lesiones (Fig. 4b) observados en LCR y suero sanos incluyen (1) la subunidad beta del receptor de IL-6 (P40189) presente en mayor abundancia en el LCR: activador de la señalización JAK-MAPK y JAK-STAT3, (2 ) la proteína accesoria del receptor IL1 (Q9NPH3), parte del sistema de señalización IL-33 responsable de la diferenciación presináptica y postsináptica de las neuronas, (3) amiloide P sérico (P02743), relacionado con la amiloidosis y la agregación en placas, (4) proteína similar al amiloide 1 (P51693), parte de la función postsináptica y regulador transcripcional, (5) proteína precursora de amiloide (P05067), una proteína de unión a metales importante para la axiogénesis, la sinaptogénesis, el crecimiento neuronal y la adhesión (entre otras funciones), y 6) γ-enolasa (P09104): una enzima neuroprotectora/neurotrófica muy importante con una amplia gama de funciones bioquímicas que se encontró exclusivamente en el LCR.

( a ) Diagramas de caja de intensidad de apolipoproteína y comparación entre LCR (azul) y suero (rojo). Proteínas amiloide A séricas (SAA#) y apolipoproteínas (letra Apo). Las apolipoproteínas son generalmente más abundantes en el suero que en el LCR, con excepción de la Apo-E. (b) Diagramas de caja de importantes proteínas neuro e inflamatorias detectadas en suero amiloide P y P1 (SAP), proteína precursora de amiloide (ABPP), interleucinas 1 y 6 (IL-1 e IL-6), γ-enolasa (ENO2). (c) Análisis de sobrerrepresentación de STRING de la guía de axones. Las proteínas marcadas en gris controlan múltiples vías bioquímicas y fueron comunes en nuestro análisis de sobrerrepresentación. Las proteínas marcadas en blanco son comunes al LCR y al suero, las proteínas marcadas en azul y exclusivas del LCR, y la proteína marcada en rojo es exclusiva del suero.

Los análisis basados ​​en vías de sobrerrepresentación que utilizan herramientas bioinformáticas son útiles para identificar patrones de proteínas asociadas con funciones bioquímicas conocidas. Aquí, utilizamos STRING de las proteínas asociadas con la guía del axón FDR = 2.14E-7 (Reactome R-HSA-422475) en el LCR y el suero se presentan en la Fig. 4c. Este análisis toma coocurrencia, coexpresión, evidencia experimental directa, minería de texto y evidencia de bases de datos para generar la agrupación establecida en el límite de confianza más alto (0,9). Cada nodo representa una única proteína y las líneas que conectan los nodos están asociadas con confianza. Las proteínas marcadas en gris (metaloproteinasa de matriz (MMP) 2/9 y homólogo indirecto 1 (ROBO1) controlan múltiples vías bioquímicas y fueron comunes en nuestro análisis de sobrerrepresentación. Las proteínas detectadas en el LCR que no se detectaron en el suero en el presente estudio incluyen; moesina (MSN, P26038), proteína priónica principal (PRNP, P04156), factor 1 derivado de células estromales (CXCL12, P48061), cadena de tubulina alfa-1B (TUBA1B, P68363), proteína de dominio de triple función (TRIO, O75962), sodio subunidad del canal beta-3 (SCN3B, Q9NY72), plexina-B1 (PLXNB1, O43157), receptor de netrina (UNC5C, O95185). Es importante destacar que muchas de estas proteínas están asociadas con la remodelación de la actina, la migración y el crecimiento celular. PLXNB1 y UNC5C son directamente responsables de la guía de los axones necesaria para la reparación del tejido neuronal después de una TBI35. La única proteína detectada en el suero, pero no detectada en el LCR, es ezrin (EZR, P15311), una proteína asociada con la guía del axón que forma complejos con radixina y moesina, parte del citoesqueleto de actina. La variación en las asociaciones de redes de vías bioquímicas, como la guía de los axones, puede proporcionar información útil cuando hay una alteración en la barrera hematoencefálica o alguna otra desregulación en la producción y función de proteínas.

En la Fig. 5 se representa una investigación de las intensidades relativas de MS de los metabolitos asignados positivamente según la clase bioquímica. En estos gráficos, cada punto representa un único metabolito y su posición x,y es la intensidad (0-100) en LCR frente a .suero. Los puntos cerca de la diagonal y = x (línea discontinua en la Fig. 5) provienen de proteínas que tienen una concentración casi igual en el LCR y el suero. Este análisis delimita las necesidades metabólicas y bioquímicas de cada fluido. Por ejemplo, los metabolitos asociados con la síntesis y el metabolismo del azúcar son más abundantes en el LCR (Fig. 5a), mientras que la síntesis y el metabolismo de los aminoácidos son más abundantes en el suero (Fig. 5b). Los niveles séricos circulantes de aminoácidos libres reflejan la ingesta de proteínas y la síntesis muscular. Por otro lado, el cerebro es el órgano con mayor demanda metabólica y representa el 20% del metabolismo del azúcar. Curiosamente, los azúcares sintéticos (p. ej., xilitol, sorbitol y manitol) se encontraron en mayor abundancia en el LCR que en el suero. De los siete neurorreguladores identificados positivamente (Fig. 5c), solo encontramos uno que se detectó tanto en el LCR como en el suero, la 5-metoxitriptamina y el ácido 5-aminovalérico, un agonista débil de GABA. La serotonina y la feniletilamina se detectaron exclusivamente en el suero, quizás debido a la adquisición del LCR por punción lumbar. También observamos que los neurorreguladores se concentran alrededor del cerebro (Fig. 5d). Los dos neurorreguladores detectados únicamente en el LCR fueron el ácido N-acetil aspártico, un aminoácido modificado que se encuentra predominantemente en las neuronas y el metabolito principal de la serotonina, el ácido 5-hidroxi-3-indolacético36. Encontramos mayor número de lípidos y esteroles sólo en suero; en particular ácido palmitoleico, ácido linoleico, ácido desoxicólico, ácido cólico, ácido cis-gondoico, ácido araquidónico y beta-glicerolfosfato (Fig. 5e). En S5 se puede encontrar una tabla completa de los metabolitos identificados y las intensidades relativas de MS.

Gráficos de las principales clases de metabolitos identificados, compuestos en mayor abundancia en suero (círculos rojos), exclusivamente en suero (triángulos rojos), compuestos en mayor abundancia en LCR (círculos azules), exclusivamente en LCR (triángulos azules) y compuestos en iguales proporciones. (dentro del 5%) abundancia (círculos negros). La línea diagonal discontinua negra representa intensidades iguales. (a) Monómeros de carbohidratos (azúcares) asociados con la síntesis y el metabolismo, así como edulcorantes artificiales. (b) Se detectaron todos los 21 aminoácidos naturales, derivados de aminoácidos y metabolitos asociados con la degradación de proteínas. (c) Los neurorreguladores detectados se encontraban principalmente en suero o LCR. d) Purinas, pirimidinas y sus derivados que forman los nucleósidos del ADN y el ARN. (e) Los lípidos de bajo peso molecular se detectaron principalmente en el suero sobre el LCR. (f) Otros metabolitos que incluyen productos del ciclo de la urea, metabolitos de alimentos y fármacos.

La asignación de vías bioquímicas a listas de proteínas y metabolitos revela funciones biológicas activas/inactivas que pueden usarse para evaluar el estado de enfermedad de un individuo. Aquí, en nuestra población normal asignamos las clases más comunes de vías encontradas mediante análisis de sobrerrepresentación a nuestra población "normal" (Tabla 1). Estos resultados se derivaron del uso de Reactome en nuestros conjuntos de datos, ya que descubrimos que es la herramienta más ilustrativa de la función bioquímica normal. De las funciones metabólicas anormales, encontramos que la activación y desgranulación de las plaquetas probablemente estén asociadas con la adquisición de muestras de los procedimientos lumbares y de venopunción. El análisis identifica muchas de las vías bioquímicas normales esperadas, incluida la organización de la matriz extracelular, la hemostasia, el sistema inmunológico, el metabolismo de proteínas y el transporte mediado por vesículas (Tabla 1). Todas las vías representadas aquí están asociadas con proteínas/metabolitos solubles que se encuentran en el suero y el LCR porque las células se eliminaron antes del perfil proteómico y metabolómico. En particular, nuestros metabolitos identificados positivamente eran bastante bajos (como es común), por lo que obtenemos una cobertura superpuesta limitada con nuestras vías identificadas por proteoma. La tabla completa de vías asociadas de proteínas detectadas (suero S6 y LCR S7) y metabolitos (suero S8 y LCR S9) que componen esta tabla se puede encontrar en el SI.

El desarrollo de nuevas terapias y diagnósticos para lesiones y lesiones neurológicas requiere tanto la identificación de biomarcadores específicos como la cuantificación asociada de concentraciones normales y anormales para determinar los umbrales para la detección de enfermedades. La llegada de nuevas herramientas ómicas ha llevado a la innovación en las primeras; sin embargo, las segundas requieren un examen en diferentes tipos de muestras. Además, a medida que avanza nuestra comprensión de la fisiopatología de las enfermedades, han surgido paneles de biomarcadores como medidas de diagnóstico más informativas que objetivos de diagnóstico únicos. Aquí presentamos análisis proteómicos y metabolómicos de 60 muestras, 30 LCR y 30 suero de individuos sin condiciones previas. Con este análisis buscamos ser lo más transparentes posible y ofrecer nuestro conjunto de datos completo de proteínas y metabolitos (SI) identificados para que otros investigadores puedan beneficiarse de una comparación de control completa. Estos perfiles proteómicos y metabolómicos se pueden utilizar como conjunto de control para otros estudios 'ómicos similares, para compararlos con conjuntos de datos existentes o para establecer umbrales en futuros esfuerzos de descubrimiento de biomarcadores, particularmente con los marcadores comunes implicados en la TBI (por ejemplo, apolipoproteínas). Además, esperamos guiar a otros al seleccionar el FDR de la proteómica DIA en una cuidadosa consideración del equilibrio de la inclusión con la precisión. Hasta donde sabemos, esta es la primera comparación tanto del metaboloma como del proteoma entre el LCR y el suero. En nuestros análisis demográficos no encontramos diferencias significativas entre el metaboloma y el proteoma según el sexo. Sin embargo, encontramos dos grupos significativos basados ​​en la edad tanto en el metaboloma como en el proteoma, lo que tiene implicaciones para el desarrollo diagnóstico posterior.

La identificación de proteínas dependía en gran medida del nivel de FDR. Existe una relación positiva entre la sensibilidad del procedimiento (probabilidad de identificar una proteína que está en la muestra) y el FDR (probabilidad de que la proteína identificada no esté en la muestra). Dado que utilizamos la identificación de proteínas como paso previo al procesamiento para reducir el ruido en nuestras mediciones, estamos dispuestos a ser inclusivos, lo que significa que utilizamos un FDR no despreciable. Descubrimos que el uso de un FDR del 10 % para la mayoría de los análisis proporcionó un buen compromiso entre los dos tipos de errores y está de acuerdo con otros informes de proteómica DIA no específicos37. Teníamos una capacidad limitada para identificar proteínas de muy baja abundancia porque decidimos no agotar la albúmina y las IgG debido al error y la irreproducibilidad de estos procedimientos de agotamiento en nuestras manos. Múltiples factores pueden afectar la intensidad medida y la concentración proporcional de las proteínas detectadas en suero y LCR. Para la mayor parte del artículo, asumimos que las intensidades de proteínas específicas no se vieron afectadas significativamente por los efectos de la matriz de muestra. La idoneidad de esta suposición depende de que las concentraciones de proteínas estén dentro del rango de cuantificación lineal del instrumento. La identificación del metaboloma está intrínsecamente limitada a la sensibilidad de los análisis BinBase de GC-MS/MS. Sin embargo, los resultados de identificación de BinBase resultaron similares a los de otros medios de identificación38. El protocolo utilizado para la metabolómica se normalizó a la altura máxima suma de todos los compuestos estructuralmente anotados de cada matriz de muestra respectiva.

Para contextualizar el metaboloma y el proteoma, analizamos las vías bioquímicas utilizando una combinación de Reactome, STRING y KEGG39,40,41. Los 216 metabolitos primarios y secundarios asignados positivamente se asignaron según KEGG y BinBase. Las 813 proteínas del suero y las 932 del LCR se asignaron a vías bioquímicas entre Reactome y STRING. Encontramos solo una superposición marginal de vías entre el metaboloma y el proteoma debido en gran parte al hecho de que estábamos buscando proteínas extracelulares, algunas de las cuales están intrínsecamente ligadas al metabolismo primario/secundario. Intentamos analizar nuestros conjuntos de datos utilizando PANTHER y DAVID; sin embargo, estas herramientas asignaron estados de enfermedad a nuestra población sana conocida en gran parte debido a cómo se construyen sus bibliotecas bioinformáticas. Si bien las asignaciones ontológicas siempre son desafiantes debido a las limitaciones de las bibliotecas bioinformáticas, nos ocupamos de contextualizar nuestra saludable población de patentes. En total, presentamos una cohorte comparativa del proteoma y el metaboloma en 30 individuos. Estos datos son una contribución al desarrollo de objetivos diagnósticos/terapéuticos para lesiones/insultos al cerebro.

Se adquirió un total de 30 muestras pareadas de LCR y suero humano (60 muestras biológicas) de 30 individuos sanos de PrecisionMed Inc. (Solana Beach, CA). El conjunto estaba compuesto por 15 hombres y 15 mujeres con edades comprendidas entre 23 y 74 años. Todos los sujetos eran caucásicos (ascendencia europea) y se sometieron a la Mini Entrevista Neuropsiquiátrica Internacional (MINI PLUS) como parte de la inclusión. Los detalles completos de los criterios de inclusión/exclusión se pueden encontrar en la Tabla S10. Se extrajeron muestras de sangre mediante venopunción y se recogieron en tubos estériles; El suero se preparó dejando que la sangre reposara a temperatura ambiente durante 15 a 30 minutos para permitir que coagulara. La sangre coagulada se centrifugó a ~ 1500 × g durante 10 minutos y el suero se distribuyó en alícuotas y se almacenó a -80 ° C. Para la recolección de líquido cefalorraquídeo, se anestesió la región lumbar de la columna con lidocaína al 2% administrada por vía subcutánea. La punción lumbar se realizó con una aguja Quincketype o Sprotte de orificio lateral 22G de 3,5 pulgadas. El bisel se colocó en línea con el eje dural cefalocaudal para minimizar el desgarro dural. La aguja se colocó entre las apófisis espinosas posteriores de L5-S1, L4-L5, L3-L4 o L2-L3 y, una vez que se observó líquido, la presión de apertura se midió con un manómetro estéril. El LCR se recogió, se repartió en alícuotas y se almacenó a -80 °C. Todas las muestras se manipularon utilizando tubos de microcentrífuga Eppendorf™ LowBind y puntas de pipeta estériles y limpias Eppendor Dualfilter TIPS PCR. El ácido fórmico de grado LCMS, el agua de grado LCMS y el acetonitrilo de grado LCMS se obtuvieron de Sigma Aldrich. Los análisis lipidómicos se realizaron en un GC Agilent 6890 equipado con Gerstel CIS4 (con inyector MPS dual) y un Pegasus III TOF MS. Los análisis proteómicos se realizaron utilizando un espectrómetro de masas Thermo Scientific Fusion Lumos funcionando en modo DIA.

Protocolo de preparación de muestras: se congelaron instantáneamente 100 ml de LCR o suero en N2 líquido en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml salinizados con baja unión y se liofilizaron hasta sequedad. Las muestras se enviaron en hielo al núcleo de proteómica de UC Davis (Davis, CA) para su procesamiento y análisis de EM. Estos métodos fueron adaptados de los protocolos generales del núcleo de proteómica de UC Davis42.

El suero liofilizado y el LCR se rehidrataron con SDS al 5% y bicarbonato de trietilamonio (TEAB) 50 mM a pH 7,55. La concentración de proteína se determinó mediante el ensayo BCA (Fig. S3) y (Pierce), se digirieron 150 μg de suero en una columna de digestión S-Trap Mini Spin y se digirieron 50 μg de LCR en una columna de digestión S-Trap Micro spin. Inicialmente, se añadió ditiotreitol (DTT) 10 mM y se incubó a 50 °C durante 10 min y se reposó a temperatura ambiente durante 10 min. A continuación, se añadió yodoacetamida (IAA) 5 mM y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad con una agitación suave. Las muestras se acidificaron con ácido fosfórico al 12% seguido de la adición de 2,348 ml de tampón S-Trap (metanol al 90%, TEAB 100 mM, pH 7,1) y se mezclaron inmediatamente. Toda la mezcla de lisado acidificado/tampón St se transfirió a la columna de centrifugación S-Trap y se centrifugó a 3000 rcf durante 1 min o hasta que toda la solución pasó a través de la columna. Las columnas se lavaron con 600 µl de tampón S-Trap y se centrifugaron a 2000 rcf hasta que se secaron. Las columnas se transfirieron a un tubo de elución limpio. Se añadió cuidadosamente tampón de digestión con enzima tripsina (enzima 1:25: proteína total en 121 µl de TEAB 50 mM, pH 8,0) a la columna y se incubó a 37 °C. Después de la primera hora, se repitió la etapa de adición de tripsina y se dejó que la digestión continuara durante la noche. Los pasos de elución del péptido incluyeron 80 µL de TEAB 50 mM (pH 8,0) seguido de centrifugación a 1000 rcf durante 1 min, 80 µL de ácido fórmico al 0,5 % seguido de centrifugación a 1000 rcf durante 1 min, 80 µL de la solución que contenía acetonitrilo al 50 %. y ácido fórmico al 0,5% seguido de centrifugación a 4000 rcf durante 1 min. La elución combinada final se secó en vacío rápido. Los péptidos se resuspendieron en TFA al 0,1 % y ACN al 2 % y se cuantificaron utilizando el ensayo fluorométrico cuantitativo de péptidos Pierce (Thermo Fisher Scientific). Se mezclaron porciones iguales de todas las muestras, según el ensayo fluorométrico de péptidos, para obtener una muestra de referencia que se analizará seis veces para las ejecuciones de la biblioteca de cromatogramas.

Los péptidos se desalinizaron y atraparon en una trampa Thermo PepMap y se separaron en una columna C18 Easy-spray de 100 μm × 25 cm utilizando un Dionex Ultimate 3000 nUPLC a 200 nL/min. Disolvente A = 0,1% de ácido fórmico, Disolvente B = 100% Acetonitrilo 0,1% de ácido fórmico. Condiciones de gradiente = 2% B a 50% B durante 60 min, seguido de 50–99% B en 6 min y luego mantenido durante 3 min, 99% B a 2% B en 2 min y un tiempo total de ejecución de 90 min usando Espectrómetro de masas Thermo Scientific Fusion Lumos funcionando en modo DIA. Las inyecciones de la biblioteca de cromatogramas fraccionados en fase gaseosa (GPF) se realizaron utilizando viudas de aislamiento escalonadas de 4 Da. GPF1 = 400–500 m/z, GPF2 = 500–600 m/z, GPF3 = 600–700 m/z, GPF4 = 700–800 m/z, GPF5 = 800–900 m/z, GPF6 = 900–1000 m/z, los espectros de masas se adquirieron utilizando una energía de colisión de 35, una resolución de 30 K, un tiempo máximo de inyección de 54 ms y un objetivo AGC de 50 K.

Cada muestra individual se procesó en modo DIA utilizando la misma configuración que la biblioteca de cromatogramas, excepto que se utilizaron ventanas de aislamiento escalonadas de 12 Da en el rango m/z de 400 a 1000 m/z. Los datos de DIA se analizaron utilizando Scaffold DIA v.2.0.0 (Proteome Software, Portland, OR, EE. UU.). Los archivos de datos sin procesar se convirtieron al formato mzML utilizando ProteoWizard v.3.0.1174843. Los cromatogramas de iones totales se pueden encontrar en S10 para LCR y S11 para suero.

La biblioteca espectral de referencia fue creada por EncyclopeDIA v.0.9.2. Se buscaron individualmente muestras de bibliotecas de cromatogramas en las bases de datos previstas de Prosit creadas con el servidor en línea de Prosit (https://www.proteomicsdb.org/prosit/) y se convirtieron para ScaffoldDIA utilizando las herramientas de la Enciclopedia44. La información para la predicción de Prosit consistió en el proteoma Uniprot UP000005640 (Homo sapiens) y 114 contaminantes comunes de laboratorio (https://www.thegpm.org/crap/) con una tolerancia de masa de péptidos de 10,0 ppm y una tolerancia de masa de fragmentos de 10,0 ppm. . Las modificaciones variables consideradas fueron: oxidación de metionina y carbamidometilo de cisteína. Se supuso que la enzima de digestión era tripsina y se permitió un máximo de 1 sitio de escisión omitido. Sólo se consideraron péptidos con cargas en el rango [2‥3] y longitud en el rango [6‥30]. Los péptidos identificados en cada búsqueda se filtraron con Percolator 3.01.nightly-13-655e4c7-dirty) para lograr un FDR máximo de 0,0145,46. Se combinaron los resultados de la búsqueda individual y los péptidos se filtraron nuevamente hasta un umbral de FDR de 0,01 para su inclusión en la biblioteca de referencia.

Las muestras analíticas se alinearon en función de los tiempos de retención y se buscaron individualmente en la biblioteca de cromatogramas creada a partir de los experimentos fraccionados en seis fases gaseosas descritos anteriormente con una tolerancia de masa de péptidos de 10,0 ppm y una tolerancia de masa de fragmentos de 10,0 ppm. Las modificaciones variables consideradas fueron: Oxidación de metionina y carbamidometilo de cisteína. Se supuso que la enzima de digestión era tripsina y se permitió un máximo de 1 sitio de escisión omitido. Sólo se consideraron péptidos con cargas en el rango [2‥3] y longitud en el rango [6‥30]. Los péptidos identificados en cada muestra se filtraron con Percolator (3.01.nightly-13-655e4c7-dirty) para lograr un FDR máximo de 0,0145,46,47. Se combinaron los resultados de búsqueda individuales y a las identificaciones de péptidos se les asignaron probabilidades de error posteriores y se filtraron a un umbral FDR de 0,01 mediante Percolator (3.01.nightly-13-655e4c7-dirty).

La cuantificación de péptidos se realizó mediante EncyclopeDIA v. 0.9.2. Para cada péptido, se seleccionaron para la cuantificación los cinco iones fragmentados de mayor calidad. Las proteínas que contenían péptidos similares y que no podían diferenciarse según el análisis MS/MS se agruparon para satisfacer los principios de parsimonia. Se investigaron proteínas con un mínimo de 1 o 2 péptidos identificados y con un FDR de 1,0 o 10,0%.

Las proteínas fueron anotadas por una combinación de STRING48 y Reactome49. Los metabolitos se procesaron en BinBase v 4.0 y KEGG. Los análisis comparativos se realizaron en Reactome, las vías informadas tenían un valor de p inferior a 10–4 (S6–S9).

Protocolo de preparación de muestras: se congelaron instantáneamente 500 ml de LCR o suero en N2 líquido en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml con baja unión salinizada y se almacenaron a -80 °C antes del envío. Las muestras se enviaron en hielo seco al Westcoast Metabolomics Core (Davis, CA) para su procesamiento y análisis de MS.

Los siguientes métodos fueron adaptados de Feihn et al.38,50,51 Las muestras se descongelaron a temperatura ambiente y se agitaron durante 10 s a baja velocidad para homogeneizar. Se dividieron en alícuotas las muestras (30 µl para suero y 50 µl para LCR) y se añadió a cada una una mezcla de disolvente de extracción de MeOH/MTBE + mezcla de control de calidad 3:10 (v/v) helada/CE 22:1 (estándar FAME). alícuota, manteniendo las muestras y el disolvente de extracción en hielo durante el procedimiento. Posteriormente, cada muestra se agitó durante 10 s (agitador de vórtice de tubos múltiples VWR VX-2500). Luego, todas las muestras se centrifugaron durante 2 minutos a 14.000 rcf. Los sobrenadantes orgánicos se separaron en dos alícuotas separadas de 450 ml, una para el análisis primario. Se transfirieron 75 µl de las fases orgánicas restantes a un tubo cónico de 50 ml para generar muestras combinadas de LCR o suero. Las fases orgánicas restantes se separaron y se mantuvieron a -20 °C como respaldo. Todas las muestras primarias y agrupadas se secaron al vacío mediante un sistema de concentración de vacío rápido (trampa fría Labcono Centrivap). Las muestras de suero se limpiaron aún más resuspendiéndolas en 500 µl de ACN:H2O 50:50 (v/v) desgasificadas con argón. Las muestras se centrifugaron durante 2 minutos a 14.000 ref y los sobrenadantes (475 μl) se transfirieron a tubos Eppendorf nuevos.

Para eliminar los lípidos muy hidrofóbicos, las muestras de suero y LCR se resuspendieron en 500 μl de ACN:H2O 50:50 (v/v) desgasificado con argón. Las muestras se centrifugaron durante 2 minutos a 14.000 ref y los sobrenadantes (475 μl) se transfirieron a tubos Eppendorf nuevos.

El Agilent 6890 GC está equipado con un sistema de intercambio automático de revestimiento Gerstel (ALEX) que incluye un carril dual de muestra multipropósito (MPS2) y un sistema de inyección en frío Gerstel CIS (Gerstel, Muehlheim, Alemania) con el siguiente programa de temperatura: 50 °C a una temperatura final de 275 °C a una velocidad de 12 °C/s y se mantuvo durante 3 min. El volumen de inyección es de 0,5 l con una velocidad de inyección de 10 l/s en un inyector sin saliva con un tiempo de purga de 25 s. Para garantizar la calidad, el revestimiento (Gerstel #011,711-010-00) se cambió cada 10 muestras (utilizando el software Maestro1 Gerstel vs. 1.1.4.18). Antes y después de cada inyección, la jeringa para inyección de 10 µl se lava tres veces con 10 µl de acetato de etilo.

Una columna Rtx-5Sil MS de 30 m de largo y 0,25 mm de diámetro interior (0,25 μm 95 %, dimetil 5 %, película de difenil polisiloxano) con una columna protectora integrada adicional de 10 m (Restek, Bellefonte PA). El helio puro al 99,9999 % con purificador incorporado (Airgas, Radnor PA) se ajusta a un flujo constante de 1 ml/minuto. La temperatura del horno se mantiene constante a 50 °C durante 1 min y luego se incrementa a 20 °C/minuto hasta 330 °C, donde se mantiene constante durante 5 min. Un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo Leco Pegasus IV está controlado por el software Leco ChromaTOF versus 2.32 (St. Joseph, MI). La temperatura de la línea de transferencia entre el cromatógrafo de gases y el espectrómetro de masas se establece en 280 °C. La ionización por impacto de electrones a 70 V se emplea con una temperatura de fuente de iones de 250 °C. La velocidad de adquisición es de 17 espectros/segundo, con un rango de masa de escaneo de 85 a 500 Da.

Los archivos de datos sin procesar se preprocesan directamente después de la adquisición de datos y se almacenan como archivos *.peg específicos de ChromaTOF, como archivos de resultados genéricos *.txt y, además, como archivos genéricos ANDI MS *.cdf. El preprocesamiento en ChromaTOF vs. 2.32 (Leco) se realiza sin suavizado, se realiza una resta de línea base junto con deconvolución espectral automática y detección de picos con S/N de 5:1. Las masas de los ápices y una salida *.txt correspondiente con los intestinos absolutos se exportan para su posterior procesamiento mediante un algoritmo de filtrado implementado en la base de datos de metabolómica BinBase v 4.0. Feihn et al. desarrollaron detalles sobre el algoritmo BinBase (https://code.google.com/p/binbase/).27,38 Los espectros se alinean automáticamente con la mezcla de control de calidad dentro de BinBase y las muestras se normalizaron a la suma de las alturas de los picos. de todos los compuestos estructuralmente identificados, para corregir los efectos de matriz del suero y el LCR. Los metabolitos conocidos se asignan a sus respectivas claves PubChem, KEGG e InChi.

Se imputaron valores de intensidad faltantes para todas las proteínas detectadas en al menos una de las muestras. Asumimos que las intensidades siguieron una distribución lognormal con un umbral de detección que varía entre proteínas y matrices. Ajustamos cada distribución truncada para encontrar la media y la varianza, aproximando el umbral como igual a la más pequeña de las intensidades observadas. Cuando se observaron menos de 3 valores de intensidad para una proteína, asumimos una media y una desviación estándar iguales al promedio de las distribuciones ajustadas (media = 4, estándar = 1). Los valores no observados se imputaron generando números aleatorios a partir de la parte censurada de las distribuciones derivadas. Para los datos de metabolómica, BinBase imputó valores de intensidad cuando se detectó un metabolito en al menos una de las muestras38. Los valores imputados se eligieron de manera que la intensidad estuviera dentro del rango del ruido inexplicable en cada espectro de masas.

Todos los análisis se realizaron después de la imputación de los valores faltantes utilizando R 3.6.3. Para evaluar si las intensidades diferían en términos del tipo de muestra (LCR versus suero), primero realizamos un análisis de componentes principales en cada uno de los conjuntos de datos de proteómica y metabolómica. Luego trazamos las muestras en los dos primeros componentes principales para observar diferencias en este espacio simplificado. Identificamos proteínas individuales que diferían significativamente en intensidad relativa entre tipos de muestras mediante la realización de pruebas t de muestras pareadas en el logaritmo de las concentraciones, ajustando los valores de p para la multiplicidad de las pruebas utilizando el método de Benjamini-Hochberg. Además, calculamos el cambio promedio en la intensidad entre los participantes para evaluar la importancia clínica de los hallazgos.

Evaluamos si los grupos de participantes parecían tener perfiles proteómicos similares. Para ello, realizamos un Análisis de Componentes Principales en cada uno de los dos tipos de muestra. Luego seleccionamos componentes para los cuales la varianza explicada parecía ser señal sobre ruido (antes del codo del gráfico de varianza explicada sobre el número de componente). Utilizando estos componentes, realizamos agrupaciones jerárquicas con la distancia de Ward y trazamos el árbol obtenido. Luego evaluamos visualmente si parecía haber grupos con perfiles similares. Luego se compararon los grupos de participantes en función de la edad y el sexo mediante pruebas t y pruebas de chi-cuadrado, respectivamente. Lo anterior se repitió con datos metabolómicos.

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Nos gustaría agradecer el apoyo financiero del DOD R-00674-19-0, Laurie Samitaur Smith y la familia Samitaur. Los primeros trabajos que condujeron a este esfuerzo se financiaron a través de un proyecto cooperativo de investigación y desarrollo entre LANL y Samitaur Medical Technologies, y agradecemos al equipo su apoyo a este esfuerzo. Nos gustaría agradecer al Centro de Proteómica del Centro del Genoma de UC Davis por la generación y el procesamiento de datos (LC-MS fue respaldado por NIH S10OD021801). Nos gustaría agradecer al Centro de Metabolómica de la Costa Oeste de UC Davis por la generación y el procesamiento de datos (NIH U2C ES030158).

Laboratorio Nacional de Los Alamos, PO Box 1663, Los Alamos, NM, 87545, EE. UU.

Laura M. Lilley, Steven Sanche, Shepard C. Moore, Dung Vu, Srinivas Iyer, Nicolas W. Hengartner y Harshini Mukundan

Centro del Genoma, Instalación Central de Proteómica, Universidad de California, Davis, CA, 95616, EE. UU.

Michelle R. Salemi

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LL fue responsable de una parte importante de la ejecución experimental, análisis de datos, generación de figuras y redacción del manuscrito. SS y NH contribuyeron al análisis de datos, estadísticas y redacción de manuscritos. SM contribuyó a los experimentos de laboratorio. MRS y SI fueron responsables del trabajo de espectrometría de masas. DV desarrolló protocolos originales y codesarrolló el diseño del estudio. HM, concibió el estudio y, como IP, obtuvo financiación, desarrolló el diseño, gestión y ejecución del estudio, redacción y edición del manuscrito. SI, DV y NH también contribuyeron al diseño y desarrollo del estudio.

Correspondencia a Harshini Mukundan.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Lilley, LM, Sanche, S., Moore, SC et al. Métodos para capturar firmas proteómicas y metabolómicas del líquido cefalorraquídeo y suero de individuos sanos. Informe científico 12, 13339 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-16598-1

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Recibido: 01 de febrero de 2022

Aceptado: 17 de mayo de 2022

Publicado: 03 de agosto de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16598-1

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